Comunicación Científica - CIVA 2006 (http://www.civa2006.org), 249-258 Caracterización de la actividad miométrica del intestino de Carassius auratus para el estudio del efecto in vitro de la melatonina en la motilidad gastrointestinal Elena Velarde, Angel L Alonso-Gómez, Nuria de Pedro, Clara Azpeleta, Laura Ortiz, María J Delgado Dpto. de Fisiología (Fisiología Animal II), Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense de Madrid (España) Resumen Summary Con el presente estudio se pretende investigar las posibles acciones de la melatonina (N-acetil-5metoxitriptamina, MEL) en la funcionalidad del tracto gastrointestinal en peces, y concretamente sobre la motilidad intestinal del carpín (Carassius auratus). Para ello hemos utilizado un modelo in vitro de intestino aislado en un baño de órganos acoplado a un transductor isométrico, que permite medir los cambios de tensión generados por el músculo liso de la pared intestinal por efecto de distintos agentes, y utilizando como referencia el intestino de otro vertebrado acuático, el anfibio anuro, Xenopus laevis. En primer lugar registramos la actividad miógena espontánea, encontrando un perfil rítmico basal diferente en cada especie, siendo los ciclos del carpín más frecuentes y de menor amplitud que los mostrados por el intestino de Xenopus. A continuación, se han realizado curvas dosis-respuesta con un agente parasimpaticomimético, la acetilcolina (ACh) que induce en ambos casos una respuesta contráctil inmediata y dependiente de la concentración de ACh. Por último, estudiamos el efecto de la adición de MEL al baño de órganos tras inducir la contracción del segmento intestinal del carpín con ACh (10 µM), observando un efecto relajante y dependiente de la concentración de MEL. Este efecto relajante es bloqueado por la preincubación con luzindol, antagonista general de los receptores de MEL. Nuestros resultados demuestran por primera vez en los peces un efecto directo y específico de la MEL sobre la motilidad intestinal, y constatan la idoneidad del método para profundizar en los mecanismos de acción de la MEL en el intestino del carpín. Characterization of the gut miometric activity from Carassius auratus for the in vitro study of the effect of melatonin on the intestinal motility The present study starts a research line on the possible effects of melatonin (N-acetyl-5methoxytryptamine, MEL) on gut function in fish, and in particular on the intestinal motility of goldfish (Carassius auratus). We used an in vitro model of isolated intestine in an organ bath engaged to an isometric transducer. This model allows the recording of changes in tension produced in the gut smooth muscle by the addition of different drugs. We used the intestine of another aquatic vertebrate, the anuran amphibian Xenopus laevis as a reference model. First, we recorded the spontaneous activity, and we found a different basal rhythmic profile for each species, cycles have higher frequency and lower amplitude in goldfish than in Xenopus. Second, we made concentration-response curves with the parasympathetic drug acetylcholine (ACh), which induces an immediate concentration-dependent contraction in both species. Finally, we studied the effect of MEL addition to the organ bath after inducing the intestine contraction with 10 µM Ach. We observed a relaxing and concentration-dependent effect on the ACh-induced contraction. This relaxing effect is blocked by the preincubation with luzindole, a MEL receptors antagonist. These results reveal for the first time a direct and specific effect of MEL on fish gut motility, and demonstrate the suitability of the method for studying the effects of this indoleamine on the gastrointestinal physiology of goldfish. Introducción La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina, MEL) ha sido considerada clásicamente como una señal neuroendocrina producida por estructuras fotosensoriales, la glándula pineal y la retina e implicada en el sistema circadiano de los organismos (1). Sin embargo, desde 1975, en que se detectó MEL por inmunohistoquímica en células enterocromafines de la mucosa digestiva (2), varios estudios han sugerido la posible síntesis de MEL en el tracto gastrointestinal de los mamíferos (3), aunque se desconocen los mecanismos de síntesis y liberación de dicha MEL de origen gastrointestinal. La presencia de MEL en el tracto gastrointestinal podría estar revelando una relación funcional entre la indolamina y el sistema digestivo. De hecho, se han descrito algunos efectos de la MEL relacionados con aspectos fisiológicos y patológicos gastrointestinales (4, 5), pero en la actualidad se desconocen los mecanismos que subyacen a estas acciones, pudiendo tratarse de efectos específicos mediados por receptores (6, 7) o bien deberse a acciones inespecíficas derivadas de sus estructura indólica (8). IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 249 En los peces se ha detectado MEL por radioinmunoensayo en el tracto gastrointestinal de varias especies (Acipenser fulvescens, Oncorhynchus mykiss y Cyprinus carpio) (9). Además, en el carpín, se ha sugerido que la MEL de origen gastrointestinal podría contribuir de forma significativa a la MEL circulante diurna (10). En la actualidad no existen estudios previos sobre el posible papel de la MEL en la funcionalidad del sistema gastrointestinal en los peces, y sin embargo se ha demostrado un papel regulador de esta indolamina en la ingestión de alimento (11, 12) y en la regulación del peso corporal (13) en varias especies de teleósteos. Hasta la fecha se desconoce el mecanismo por el que la MEL ejerce dicha acción anoréxica en los peces. Con el presente estudio se inicia una vía de investigación de las posibles acciones de la MEL sobre la funcionalidad del tracto gastrointestinal en peces, y más concretamente sobre la motilidad intestinal del carpín. Para ello hemos utilizado un modelo in vitro de intestino aislado en un baño de órganos acoplado a un transductor isométrico. Este sistema, anteriormente utilizado para estudiar acciones de la MEL sobre el músculo liso vascular de rata (14, 15), permite medir los cambios de tensión generados por el músculo liso de la pared intestinal inducidos por distintos agentes. Para la puesta a punto de este método en el carpín, utilizamos como referencia el intestino de otro vertebrado acuático, el anfibio anuro, Xenopus laevis, que muestra condiciones generales de cultivo en baño de órganos similares a las de la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) (16). En primer lugar se caracterizó la viabilidad del sistema a partir del registro de la actividad miógena espontánea mostrada en ambas especies, Xenopus y carpín. A continuación, se realizaron las curvas concentración-respuesta con un agente parasimpaticomimético, la acetilcolina (ACh). Por último, y únicamente en el carpín, se ha estudiado el efecto de distintas dosis de MEL sobre la contracción intestinal inducida por la ACh, y la reversión de dicho efecto con luzindol, antagonista general de los receptores de MEL. Material y métodos Animales Ejemplares de carpín (Carassius auratus, 50-60 g, peso corporal) obtenidos de un proveedor comercial, se mantuvieron en acuarios de 60 l con agua continuamente filtrada y aireada, a una temperatura de 22 ± 1ºC, fotoperiodo 12L:12D, y alimentación diaria (1% del peso corporal) con una dieta comercial (Sera Biogran). Los ejemplares de Xenopus laevis (30-40 g, peso corporal) se mantuvieron en acuarios de 10 l a una temperatura de 22 ± 1ºC, fotoperiodo 12L:12D y alimentación a base de hígado de pollo dos veces por semana. Preparaciones intestinales Los animales fueron sacrificados por decapitación y el intestino completo fue rápidamente extraído y limpiado para eliminar los restos de grasa perivisceral y de comida intraluminal. El intestino de carpín se deposita inmediatamente en una placa Petri inmerso en solución Ringer para peces a 25ºC, conteniendo: NaCl 140 mM, KCl 2.5 mM, CaCl2 1.5 mM, MgSO4•7H2O 0.8 mM, NaHCO3 15.0 mM, KH2PO4 1.0 mM, Hepes 5.0 mM, glucosa 10.0 mM, a pH 7.8-8.0. El intestino de Xenopus se depositó en una placa con medio MKRS (McKenzie’s Ringer’s solution) a 25ºC conteniendo: NaCl 115 mM, KCl 4.6 mM, NaHCO3 20 mM, MgSO4•7H2O 1.4 mM, CaCl2 1.71 mM, Hepes 5.5 mM y glucosa 16.7 mM y pH 7.8-8.0. Segmentos intestinales longitudinales de 10 mm de longitud obtenidos de la región más proximal al estómago fueron introducidos en cámaras de un baño de órganos a 25ºC conteniendo 10 ml del medio correspondiente (Ringer o MKRS) y burbujeadas de forma continua con una mezcla de O2 (95%) y CO2 (5%). IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 250 Cada segmento intestinal se coloca en sentido longitudinal, con un extremo sujeto a un soporte fijo de metacrilato y el otro unido a un elemento móvil conectado al transductor. La tensión basal óptima fue fijada para ambas especies en 10 mN (1 g), y las preparaciones se dejan estabilizar durante una hora antes de aplicarles los distintos agentes. Las pérdidas de tensión durante este tiempo de estabilización se corrigen de forma inmediata hasta alcanzar de nuevo y de forma estable los 10 mN. Diseños experimentales Registro de la actividad miógena espontánea El registro de la actividad miógena espontánea se realizó siempre tras una hora de estabilización de la preparación intestinal y una vez comprobado que la preparación no pierde tensión. Una vez estabilizado el sistema, y durante el tiempo de registro de la actividad miógena espontánea, prefijado en 5 min, el medio del baño no se renueva. Los cambios de fuerza en la preparación se miden utilizando transductores isométricos (LCM systems, Ltd.) y a través de un amplificador (Cibertec) se registran y visualizan mediante un PC utilizando el software de adquisición de datos (ADQ2C, Micronec). La actividad miógena espontánea se evaluó midiendo la amplitud y la frecuencia de las contracciones espontáneas. La amplitud de las contracciones se expresa en mN y la frecuencia se expresa en ciclos por minuto Estimulación de la contracción intestinal con acetilcolina Se utilizó un intervalo de concentraciones finales de acetilcolina (ACh, Sigma) entre 1 nM y 10 mM, preparadas a partir de una solución madre de ACh 100 mM en agua destilada. Transcurrida la hora de estabilización se añade 1 ml de la concentración correspondiente de acetilcolina (en orden creciente) a las cámaras conteniendo 9 ml de medio, y se registró la actividad contráctil durante 5 min. Tras finalizar cada registro, se renovó el medio de las cámaras 3 veces y se permite que el segmento intestinal se reestabilice durante 15 min antes de añadir la siguiente concentración de acetilcolina. Las contracciones inducidas por la ACh se expresan en mN. Efecto de la melatonina en la respuesta contráctil inducida por acetilcolina La MEL (Sigma) se disolvió en etanol y se diluyó en agua destilada hasta obtener una solución madre de 1 mM (conteniendo menos del 0.5% de etanol), a partir de la cual se prepararon las sucesivas diluciones hasta conseguir un intervalo de concentraciones finales de MEL entre 10 pM y 100 μM. Transcurrida la hora de estabilización, el intestino se estimuló añadiendo 1 ml de ACh 10 μM a 9 ml de medio. A los 20 s de alcanzar la contracción máxima se añade 1 ml de la concentración correspondiente de MEL (en orden creciente). Al finalizar cada registro, el medio de las cámaras se renovó 3 veces y se permite que el tejido se reestabilice durante 15 min antes de añadir la siguiente concentración de MEL. Efecto del luzindol en la relajación inducida por melatonina El luzindol (Tocris) se disolvió en etanol y se diluyó en agua destilada hasta obtener una solución madre de 1 mM (conteniendo menos del 0.5% de etanol), a partir de la cual se prepararon las sucesivas diluciones hasta conseguir un intervalo de concentraciones finales del antagonista entre 10 pM y 100 μM. Los segmentos intestinales se preincubaron durante 10 min en presencia de las distintas concentraciones de luzindol, tras lo cual se estimula la respuesta contráctil con 1 ml de IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 251 ACh (10 µM), y a los 20 s de alcanzar la contracción máxima se añadió 1 ml de MEL (1 nM). Se estableció un tiempo de registro de 5 min, y una vez finalizado se renovó el medio de las cámaras 3 veces, permitiendo que el tejido se reestabilice durante 15 min antes de ensayar la siguiente concentración de luzindol. Resultados Los registros de la actividad miógena espontánea de segmentos intestinales de X. laevis (A) y de C. auratus (B) tras 1 hora de estabilización se presentan en la Figura 1. En primer lugar hay que indicar que la preparación intestinal del carpín muestra durante el periodo de estabilización previo una pérdida de tono muscular más prolongada que la de Xenopus, alargando su tiempo de estabilización. Esta diferencia puede deberse a la distinta densidad de tejido muscular, sensiblemente inferior en el carpín. Figura 1 Perfiles tipo de la actividad miógena espontánea de segmentos intestinales longitudinales de Carassius auratus (a) y de Xenopus laevis (b). Aparece representada la escala temporal (en min) y cada contracción espontánea se mide en términos de fuerza (se representan 4 mN). a) b) En la Tabla I se indica la longitud total del intestino en ambas especies, que es notablemente superior (aproximadamente 5 veces) en el carpín respecto del Xenopus y se resumen los parámetros que caracterizan la actividad miógena espontánea para ambas especies. Como puede observarse (Fig. 1, Tabla I) el ritmo de actividad espontánea en el carpín muestra una frecuencia significativamente superior y una amplitud significativamente inferior que en el Xenopus. Tabla I Caracterización de la actividad miógena espontánea de segmentos intestinales de C. auratus y X. laevis. Longitud total intestino (cm) Frecuencia (ciclos/min) Amplitud (mM) C. auratus 27.4 ± 3.2 5.44 ± 0.12** 2.78 ± 0.32** X. laevis 5.7 ± 1.2 1.56 ± 0.13 9.35 ± 0.49 ** p<0.001. La adición de ACh al baño de órganos induce una contracción intestinal inmediata y pronunciada, con una amplitud directamente proporcional a la dosis de ACh aplicada. En la Figura 2 representamos dicha respuesta contráctil expresada en porcentaje respecto a la contracción máxima alcanzada en cada una de las dos especies estudiadas. IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 252 Figura 2 Curvas concentración-respuesta del efecto contráctil producido por la acetilcolina en segmentos intestinales de Carassius auratus y Xenopus laevis en baño de órganos. Contracción (%) 100 80 60 40 C. auratus 20 X. laevis 0 10 -9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 Acetilcolina (M) Se considera 100% a la contracción máxima obtenida para cada especie (véase la Tabla II). El resto de los valores se representa en porcentajes respecto a dicha contracción máxima. Los datos se expresan como media ± SEM. Se puede observar que el intestino de Xenopus responde a concentraciones ligeramente inferiores de ACh (10-9 frente a 10-8 M), alcanzando su contracción máxima a dosis más bajas (10-4 frente a 10-2 M). Los valores absolutos de las contracciones máximas alcanzadas (Tabla II) son similares en ambas especies. Tabla II Contracciones máximas inducidas por acetilcolina en segmentos intestinales de C. auratus y X. laevis. Acetilcolina 10 -9 Contracción máxima (mM) C. auratus X. laevis - 1.01 ± 0.18 10-8 1.49 ± 0.37 4.78 ± 0.62 10 -7 2.94 ± 0.60 12.75 ± 1.28 10 -6 7.65 ± 0.64 16.09 ± 0.92 10 -5 26.82± 1.96 23.04 ± 2.02 10 -4 26.68 ± 0.75 27.97 ± 2.05 10 -3 32.18 ± 0.34 27.54 ± 1.45 10 -2 29.67 ± 2.11 - En la Figura 3a se muestra un registro tipo de la respuesta a la adición de MEL mostrada por un segmento intestinal de carpín previamente contraído con ACh. Puede observarse un efecto relajante inmediato tras la adición de la indolamina. Los resultados obtenidos con las distintas concentraciones de MEL empleadas (10 pM-100 μM) se pueden observar en la Figura 3b, en la que se ha representado el porcentaje de relajación producido por la MEL respecto a la contracción inducida por una concentración predeterminada de ACh (10-5 M). IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 253 La relajación es observable a partir de una concentración de MEL de 10-12 M, e incrementa de forma progresiva hasta 10-10 M, a partir de la cual el efecto relajante no aumenta y se mantiene en torno al 16%. Figura 3 a) Perfil tipo del efecto de la adición de MEL (10 µM) a una preparación intestinal de Carassius auratus previamente contraído con ACh (10 µM), en el que se observa la relajación inmediata producida por la indolamina. b) Curva concentración-respuesta del efecto de la MEL sobre segmentos intestinales de Carassius auratus en baño de órganos previamente contraídos con ACh (10 µM). 20 Relajación (%) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 a 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 Melatonina (M) b La relajación se expresa en porcentaje respecto a la contracción inducida por la ACh. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6/concentración de MEL ensayada). La adición de luzindol al baño de órganos no tiene ningún efecto por si misma sobre la actividad miógena espontánea de los segmentos intestinales de carpín (datos no mostrados). Sin embargo, la preincubación con distintas concentraciones del antagonista produce un bloqueo concentración-dependiente de la relajación inducida por MEL (Figura 4). Dicha reversión por luzindol del efecto relajante de la MEL llega a alcanzar valores del 80% de reducción a partir de concentraciones de 10-6 M. Figura 4 Efecto de distintas concentraciones de luzindol, en porcentaje, sobre la relajación inducida por MEL, considerando 100% a la relajación máxima que produce la MEL (1 nM) en ausencia de luzindol. 100 Relajación (%) 80 60 40 20 0 0 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Luzindol (M) Los datos se presentan como media ± SEM (n=6/concentración de luzindol ensayada). IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 254 Discusión En el presente estudio se pone de manifiesto la viabilidad de un sistema de baño de órganos para la caracterización de la motilidad intestinal del carpín dorado (Carassius auratus), en comparación con la mostrada por Xenopus laevis, y su respuesta a reguladores, como la ACh y la MEL. En primer lugar, nuestros resultados demuestran la existencia de una actividad miógena espontánea en segmentos intestinales longitudinales de ambas especies, hecho que no había sido investigado con anterioridad en el carpín. La actividad espontánea hallada en el intestino del carpín, respecto a la hallada en Xenopus, muestra alta frecuencia y baja amplitud, confirmando un estudio anterior en esta misma especie (16). En los peces, el único estudio previo, realizado en la trucha, no pone de manifiesto dicha actividad miógena espontánea de segmentos intestinales (16). Puesto que la existencia de un tono miógeno basal parece ser una característica general del intestino de los vertebrados, consideramos que esta falta de actividad espontánea en la trucha puede atribuirse a dificultades metodológicas. Las diferencias en frecuencia y amplitud del ritmo espontáneo entre especies se justifican en base a las bien conocidas diferencias en las características morfofuncionales del intestino, derivadas principalmente de su adaptación a distintos patrones de alimentación entre especies (17). La motilidad intestinal in vivo, que asegura un tránsito y aprovechamiento adecuados del alimento digerido, es resultado del funcionamiento simultáneo de varios mecanismos reguladores de la contracción del músculo liso intestinal, incluyendo tanto la inervación intrínseca y extrínseca, como las acciones de los mediadores endocrinos liberados localmente (17). En nuestro estudio hemos ensayado la acción de un agonista parasimpático, la ACh, como agente inductor de contractilidad intestinal, encontrando en ambas especies, y de acuerdo con lo esperado, un efecto contráctil dependiente de concentración. El intestino de Xenopus parece mostrar una sensibilidad a la ACh ligeramente superior a la del carpín, respondiendo a dosis más bajas del parasimpaticomimético, si bien la contracción máxima alcanzada por el intestino en este sistema es muy similar en ambas especies. Por tanto, nuestros resultados nos llevan a proponer a este protocolo de contracción intestinal inducida por ACh en baño de órganos como modelo válido para reproducir in vitro el aumento de motilidad intestinal por descarga vagal in vivo, y sobre el que investigar efectos de otros posibles agentes reguladores de la motilidad. Precisamente en este sentido, nuestros resultados demuestran, por primera vez en los peces, que la MEL puede modificar la motilidad intestinal, produciendo relajación inmediata, pero parcial, de la preparación intestinal estimulada con ACh. En estudios previos realizados en la rata se ha descrito que la MEL reduce el tono y la amplitud de las contracciones espontáneas de segmentos aislados de ileon, pero sin obtener efectos dependientes de la concentración (18), por lo que los autores proponen que puede tratarse de un efecto inespecífico, posiblemente mediado por receptores de serotonina. Estudios posteriores, también en la rata, han sugerido que la MEL, especialmente durante la noche, puede actuar como un regulador local, disminuyendo el tono muscular y produciendo cambios de motilidad en músculo liso intestinal (19). Nuestros resultados de concentración-respuesta a MEL sugieren que estamos ante un efecto que puede ser fisiológico en los peces (se produce a concentraciones fisiológicas de la indolamina). Para poder confirmar esta hipótesis se requeriría demostrar la existencia de receptores específicos para MEL en el intestino. Sin embargo, en la actualidad numerosos estudios han descrito una amplia distribución de sitios de unión de MEL en el encéfalo de varias especies de teleósteos (20, 21), pero apenas se ha investigado la posible localización periférica de receptores de MEL en los peces (22, 23). Por el contrario, varios estudios han IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 255 propuesto la existencia de sitios de unión de MEL en el tracto gastrointestinal de diversas especies de aves y mamíferos (6, 7, 24, 25). En el carpín, la reversión por luzindol (potente antagonista competitivo de receptores de MEL) del efecto relajante de la indolamina, apoya la especificidad de este efecto de la MEL, reforzando la presencia de receptores funcionales de MEL en el intestino. En estudios realizados con sistemas de baño de órganos similares al utilizado en el presente trabajo se ha propuesto un papel de la MEL en la contractilidad del músculo liso vascular. Sin embargo, los resultados respecto al efecto de la MEL sobre la contractilidad del músculo liso vascular en la rata son muy variados, así se han propuesto efectos relajantes, contráctiles e incluso potenciadores de la contracción inducida por estimulación adrenérgica (15, 26). Posiblemente, como han sugerido Doblen et al. (15), los efectos contráctiles de la MEL en el músculo liso vascular puedan estar mediados por distinto tipo de receptor. La relajación parece estar mediada por receptores de tipo MT2, que son los más abundantes en el intestino de la rata (25) y cuya activación inhibe el incremento de calcio intracelular, mientras que la potenciación de la vasoconstricción estaría mediada a través de otro subtipo de receptor (posiblemente MT1) (15). Situaciones similares, es decir, distintas respuestas dependientes del tipo de receptor, son frecuentes para otros ligandos endógenos de los organismos. El desarrollo de agonistas y antagonistas selectivos para los distintos subtipos de receptores de MEL resulta esencial para dilucidar el papel de estos subtipos de receptores en la modulación del tono muscular por MEL. Es bien conocido que la contracción de las células del músculo liso requiere un incremento en la concentración de calcio intracelular (bien por entrada desde el exterior celular a través de canales de membrana, o bien por liberación de los almacenes intracelulares). En la trucha se ha descrito que la activación colinérgica del músculo liso intestinal depende principalmente de la movilización externa de calcio (27). Teniendo en cuenta que en nuestro estudio estamos observando una acción relajante de la MEL sobre una contracción colinérgica, resulta atractivo proponer que los efectos de la MEL en el intestino del carpín pueden estar implicando un bloqueo de canales de calcio dependientes de voltaje, como se ha sugerido en su acción sobre la pared vascular de la rata (28) o por inhibición de la calmodulina, como recientemente se ha propuesto para el músculo esquelético de la rata (29). No obstante otras posibilidades también pueden ser contempladas, por ejemplo a través de la activación de receptores de GABA, y posterior reducción del calcio, como se ha propuesto en varios modelos tisulares (retina, techo óptico) de Xenopus (29). Obviamente, se requiere realizar estudios adicionales para poder dilucidar estas distintas opciones. Finalmente, indicar que nuestros resultados sobre el efecto de la MEL en la motilidad intestinal del carpín, amplían la información disponible sobre las posibles funciones de esta indolamina en la regulación de la alimentación en los peces. En la inhibición del apetito producida por MEL en el carpín (11, 12) puede estar implicada una menor motilidad gastrointestinal (presentes resultados), que si llegan a producir un retraso del vaciamiento intestinal originarían una señal periférica de saciedad, reforzando de este modo el papel anorexigénico de esta hormona en este teleósteo. En conclusión, nuestro estudio pone de manifiesto la idoneidad del método empleado para el análisis de la regulación local de la motilidad gastrointestinal en los peces, y demuestra por primera vez en este grupo de vertebrados que la MEL produce relajación de la contracción intestinal a dosis fisiológicas, sugiriendo la existencia de receptores específicos para dicha indolamina en el intestino del carpín. IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 256 Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia (AGL2004-08137-C0401), E. Velarde es beneficiaria de una beca predoctoral del MEC asociada a dicho proyecto. Referencias 1. FALCON J. Cellular circadian clocks in the pineal. Prog. Neurobiol. 1999; 58:21-62 2. RAIKLIN NT, KVETNOY IM, TOLKACHEV VN. Melatonin may be synthesized in enterochromaffin cells. Nature 1975; 255:344-5 3. BUBENIK GA, HACKER RR, BROWN GM, BAROS L. Melatonin concentrations in the luminal fluid, mucosa and muscularis of the bovine and porcine gastrointestinal tract. J. Pineal Res. 1999; 26:56-63 4. MOTILVA V, CABEZA J, ALARCÓN DE LA LASTRA C. New issues about melatonin and its effects on the digestive system. Current Pharmacological Design 2001; 7(10):909-31 5. BUBENIK GA. Gastrointestinal melatonin: localization, function and clinical relevance. Dig. Dis. Sci. 2002; 47:2336-48 6. LEE PPN, PANG SF. 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