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Prueba ELISA para la determinación cuantitativa de Gonadotropina Coriónica humana
(hCG) en suero humano
$%&'&()*+,-(./&0.&')1+!&
53040
96 determinaciones
!"#$%
Estuche completo
!&'(%
2'3.4%&5,')3
La Gonadotropina Coriónica humana (hCG) es una hormona
glicoproteica, secretada por las células trofoblásticas del tejido
placentario. El papel fisiológico principal de esta hormona es mantener
el cuerpo lúteo durante el embarazo. La hCG es el más importante
marcador del embarazo. Mientras el nivel de hCG en mujeres no
embarazadas y hombres sanos está normalmente bajo 1 a 2 UI/l, la
hCG se eleva rápidamente después de la concepción y puede
alcanzar concentraciones de 10 a 30 UI/l en la primera semana de
embarazo. Durante un embarazo normal los valores de hCG se
duplican cada 1,3 a 2 días, alcanzando el nivel más elevado entre las
semanas 8 a 12. Después de este incremento el nivel de hCG
disminuye lentamente hasta una concentración que se mantiene
durante todo el embarazo. Luego del término del embarazo el nivel de
hCG disminuye rápidamente al valor normal.
$%,(+,4,3
6.7*(/8,+!.9:;.6
El análisis hCG ELISA está basado en la clásica técnica ELISA
sandwich haciendo uso del sistema de alta afinidad BiotinaEstreptavidina. Se recubren micropocillos ELISA con Estreptavidina.
En la primera etapa de incubación, se mezclan muestras, calibradores
o controles y el conjugado enzimático-anticuerpo (anticuerpos mono-,
polyclonales anti-hCG marcados con peroxidasa o biotinados) para
formar el complejo sandwich que se fija a la superficie de los
micropocillos por la interacción de la biotina con la estreptavidina
inmovilizada. Al final de la incubación, el exceso de conjugado y
antígenos no fijados son eliminados por lavado. Se agrega
TMB/Sustrato (etapa 2), se forma un color azul que se transforma a
amarillo después de parar la reacción. La intensidad del color es
directamente proporcional a la concentración de hCG en la muestra.
La absorbancia de los calibradores y muestras se determina haciendo
uso de un lector de micropocillos ELISA (HUMAREADER). La
concentración en la muestra problema se evalúa interpolando en una
curva de dosis-respuesta, obtenida utilizando suero calibradores de
concentraciones conocidas de hCG.
<&*+),53'.=.+3()&(,/3'
!)&*% 12
>,%*'./&.?,+%343+,003'.(en portatiras)
Tiras /,5,',@0&'.de 8 pocillos, recubiertos con
estreptavidina
!*+,% A - F
"*0,@%*/3%&'.(tapa blanca)
6x2,0ml listos para usar, en suero humano
Concentraciones de hCG: 0 (;), 5,0 (A), 25,0 ("), 50,0
(B), 100,0 (9) y 250 (C).UI/l.
!*-.% 13 ml "3(D1E*/3.&(F,GH),+36*(),+1&%43 (tapa blanca)
listo para usar, coloreado violeta.
pH 7,45 ! 0,1
anti-hCG (cabra), marcado con Peroxidasa, anti-hCG
(monoclonal, ratón), biotinado
1,0 µg/ml
20 ml 7301+,-(./&.I*5*/3.(tapa negra)
!/0%
Concentrado para 1000 ml
pH 8,8 ! 0,4
Buffer MOPS salino
5 mmol/l
7,0 ml <&*+),53.71@')%*)3.;.(tapa amarilla)
!0+%
pH 3,5 ! 0,1
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)
4 mmol/l
Buffer Acetato de Sodio
0,05 mol/l
7,0 ml <&*+),53.71@')%*)3.A.(tapa azul)
!01%
pH 4,5 ! 0,1
Peróxido de Urea Hidrógeno
10 mmol/l
Buffer Acetato de Sodio
0,05 mol/l
!02-3% 7,5 ml 7301+,-(./&.$*%*/*.(tapa roja)
Acido sulfúrico
0,5 mol/l
1
>,%*.*/!&',5*
Agentes preservantes: Concentración total " 0,04%
J3)*'./&.'&E1%,/*/
No ingerir los reactivos. Evitar el contacto con los ojos, piel y membranas
mucosas. Todas las muestras de pacientes y !*+,% deberían ser manipulados
como posibles agentes potencialmente infecciosos. !*+,% han sido encontrados
negativos para HBsAg y anticuerpos contra VHC y VIH 1 + 2 en los donantes.
Usar ropa protectora y guantes desechables según las buenas
prácticas de laboratorio (GLP).
Todos los materiales contaminados con muestras o !*+,% deben
inactivarse por métodos aprobados (autoclavado o tratamiento
químico) según las regulaciones aplicables.
!02-3% irrita los ojos, la piel y membranas mucosas. En caso de
contacto, lavar intensamente con abundante agua y consultar un
médico.
9')*@,0,/*/
Los reactivos son estables hasta las fechas de expiración señaladas
en las etiquetas individuales cuando se almacenan a 2...8°C.
Después de abiertos, los reactivos deben almacenarse a 2...8°C y
utilizarse dentro de 60 días (ver “Nota”).
!)&*%
- están selladas en un envase de aluminio con un desecante.
- Antes de abrir, las tiras deben estar a )&G4&%*)1%*.*G@,&()&.
- Las tiras no utilizadas deberán ser devueltas al envase con cierre y
almacenadas con el desecante. Las tiras almacenadas de esta
manera a 2...8°C pueden ser usadas hasta la fecha de expiración
(ver “Nota”).
! No tocar el anillo superior o el fondo de los micropocillos con los
dedos.
$%&4*%*+,-(./&.%&*+),53'
Todos los reactivos deben estar a )&G4&%*)1%*.*G@,&()& (15...25°C)
antes del uso. Los reactivos que no están en uso deberían siempre
estar almacenados a 2...8°C.
!/+04%
!"#$%&'()*+),-./.0")*+)1.2.*")!/+04%
- 2(*.0,E&%*.)1%@,/&F.K1&.41&/&.*4*%&+&%.&(.&0.+3(+&()%*/3.!/0%
'&./,'1&05&.+3G40&)*G&()&./1%*()&.0*./,01+,-(L
- Diluir !/0% a 1000 ml con agua desionizada fresca en un envase
apropriado. Enjuagar el envase varias veces.
- Estabilidad: MN./O*'.*.PQLLLRQS".
!"#$%&'()*+),-./.0")!$/3,-.," !051%
! Para un uso prologado: preparar cantidad necesaria mezclando
porciones iguales !0+% y !01%. Usar solamente un envase plástico
limpio previamente enjuagado con agua desionizada.
- Utilizar dentro de 30 días: Verter el contenido de un frasco de !0+%
en un frasco de !01% y mezclar. Almacenar de 2...8°C.
- ¡Manipular !051% cuidadosamente y evitar la contaminación! ¡No
utilizar si es de color azul!
- Almacenar la solución protegida de la luz intensa.
! Estabilidad: TN./U*.*.RLLLVS".
?1&')%*
Suero
No usar muestras hiperlipémicas o hemolizadas.
Las muestras pueden almacenarse por 5 días a 2...8°C, o por hasta
30 dias a -20°C. "3(E&0*%. =. /&'+3(E&0*%. '30*G&()&. 1(*. 5&FL. Al
descongelar una muestra debe ser homogeneizada. Eliminar el
material particulado por centrifugación o filtración.
$%3+&/,G,&()3
7&E1,%.&0.4%3+&/,G,&()3.&W*+)*G&()&.+3G3.'&./&'+%,@&L
4",.3)*+)$3"
U1: No mezclar o usar componentes de diferentes números de lote. No mezclar
tapas de envases (riesgo de contaminación). No usar reactivos despúes de sus
fechas de expiración.
U2: No usar reactivos que pueden ser contaminados o que tienen aspecto
diferente o olen diferentemente que normal.
U3: Notar el reparto !*+,%, las muestras y los controles cuidadosamente en la
hoja provista en el estuche.
U4: !)&*% – sacar el número requerido y colocarlos firmemente en el portatiras.
U5: Analizar cada !*+,%, control o muestra por duplicado. Pipetearlos en el
fondo de los micropocillos.
U6: Siempre deben agregarse los reactivos en el mismo orden y tiempo para
minimizar diferencias en los tiempos de reacción entre los micropocillos. Es
importante para obtener resultados reproducibles. El pipeteo de las muestras no
debería exceder de 10 minutos. De lo contrario pipetear la curva !*+,% en las
posiciones indicadas en la mitad del intervalo de la serie. Si se emplea más de
una placa, repetir la curva de calibración para cada placa.
U7: Evitar/remover burbujas de aire antes de las incubaciones y lecturas de
absorbancia.
U8: !051% inicia y !02-3% termina una reacción cinética. Evitar la luz intensa
durante el desarrollo del color.
U9: !)&*%.
!)&*% 6.Después de cada pipeteo agitar suavemente durante 20-30 sec.
sin verter las soluciones para asegurar una buena mezcla. Si está disponible,
mezclar en un mezclador de pocillos (p.ej. HUMAREADER).
738$+6.)*+)9&9+,+"
Los reactivos y las muestras deberían estar a temperatura ambiente
antes del uso.
9)*4*.P
$3+,003..XY0Z
;PLLLBR
9RLLL
Calibradores
!*+,%6A-F; en duplicado
Muestras, Controles; en duplicado
!*-.%
Muestras
25
--
-100
25
100
300
300
100
100
50
50
Mezclar y cubrir !)&*%6con cinta adhesiva
Incubar por 60 min. a 20...25°C
Lavar 3 veces como se describe (ver L1 – L3)
!/+04%
9)*4*.R
!051%
Incubar por 15 min. a 20...25°C (ver U8)
!02-3%
Mezclar cuidadosamente
Medir la absorbancia a [QN.(G lo más pronto posible o /&()%3. /&
PN. G,(L. después de terminar la reacción usando una longitud de
onda de referencia de 630-690 nm (si está disponible).
\*0,/*+,-(./&.0*.4%1&@*
Los resultados son válidos si se cumplen los siguientes criterios :
Absorbancia máxima ( !*+,% C) D.O.
!"#$%
Concentración hCG al 80% absorbancia máx.
= 170 ! 35 UI/l
Concentración hCG al 50% absorbancia máx.
= 95 ! 20 UI/l
Concentración hCG al 20% absorbancia máx . = 35 ! 7 UI/l
"H0+103
Una curva de calibración se usa para interpolar la concentración de
hCG en las muestras desconocidas.
1. !*+,% - Graficar la absorbancia de los duplicados contra la correspondiente concentración de hCG en UI/l sobre papel milimetrado
lineal (no promediar los duplicados de los calibradores antes de
graficar).
2. Trazar la mejor curva a través de los puntos graficados.
3. Para determinar la concentración de hCG en una muestra
desconocida (S), localizar el promedio de absorbancia de los
duplicados sobre el eje vertical del gráfico, hallar el punto de
intersección sobre la curva, y leer la concentración (en UI/l) en el
eje horizontal del gráfico (ver ilustración).
:()&%4%&)*+,-(./&.%&'10)*/3'
Debido a que la hormona hCG puede ser secretada en una variedad
de neoplasias trofoblásticas y no trofoblásticas, tales casos deben
excluirse antes de un diagnóstico de embarazo.
Pacientes bajo terapia hormonal pueden mostrar resultados falsos
positivos debido a la administración de hCG o por estimulación de las
células productoras de esta hormona. Microabortos espontáneos y
terapias inductoras de abortos pueden producir un rápido descenso y
consecuentemente bajos niveles de hCG, aunque en ciertos casos la
hCG puede persistir durante algunas semanas.
Embarazos ectópicos usualmente presentan valores más bajos de
hCG comparados con embarazos normales. Sin embargo, debido a
amplias variaciones fisiológicas, una sola determinación no es
suficiente para diferenciar un embarazo ectópico de un embarazo
normal. En tales casos se recomienda determinar la velocidad de
duplicación de los valores de hCG, que debería ser aproximadamente
de 1,3 a 2 días en embarazos normales. Velocidades de duplicación
inferiores pueden ser indicadores de embarazo ectópico. El
diagnóstico final no debe basarse solamente en las determinaciones
de hCG. Deben realizarse otros procedimientos diagnósticos.
\*03%&'.&'4&%*/3'
Niveles de hCG durante el embarazo normal
>,&G43./&.0*.+3(+&4+,-(
!"#.X2:]0Z
10 - 30
30 - 100
100 - 1000
1000 - 10000
30000 - >100000
10000 - 30000
5000 - 15000
1ª semana
2ª semana
3ª semana
4ª semana
2° - 3° mes
2° trimestre
3° trimestre
Cada laboratorio debería determinar sus propios rangos de referencia
utilizando los instrumentos/equipos, métodos de colección de sangre y
técnicas de análisis usuales empleados normalmente en dicho
laboratorio.
B*)3'./&.%&(/,G,&()3
La prueba hCG ELISA tiene una sensibilidad analítica de
aproximadamente 0,8 UI/l hCG.
Las muestras con concentraciones sobre 250 UI/l pueden diluirse con
suero normal masculino y ser reanalizadas. Para obtener la
concentración de estas muestras se multiplica el resultado por el
factor de dilución.
El análisis se estandardizó según el estandar OMS 3o IS (75/537)
para HCG.
Los datos típicos de ejecución de la prueba pueden ser encontrados
en el informe de verificación, accesible vía
www.human.de/data/gb/vr/el-hcg.pdf o
www.human-de.com/data/gb/vr/el-hcg.pdf
J3)*
Los componentes del estuche son estables hasta la expiración aún
después de abiertos. Sin embargo, la posibilidad de una contaminación
está directamente relacionada con el número de tomas del reactivo. Por lo
tanto, el límite de 60 días en viales abiertos se fijó por razones de
seguridad.
La manipulación debería siempre estar de acuerdo con las buenas
prácticas de laboratorio (GLP*). ¡Los criterios de validación del análisis
deben cumplirse siempre!
(*Esto incluye: Colocar la tapa debida en el vial y cerrarlo firmemente / Sacar de los
viales de stock solamente los reactivos necesarios para la corrida si entraran en contacto
con otras soluciones contaminantes como lo son las muestras, etc. / Las soluciones de
stock siempre deben regresarse a 2...8°C si no se usan.)
2 ,5
2
;.[QN
5-"%+*&6&+(,")*+)#.2.*"
El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente producirá una
mala precisión o absorbancias falsamente elevadas.
L1: Remover las tiras adhesivas, aspirar el contenido, agregar !/+04%, aspirar
después de aproximadamente 30 sec. de enjuague y repetir el lavado.
IR: En el caso de lavadores automáticos, se deben cebar con !/+04%
y lavar los pocillos 3 veces. Asegurarse que el lavador llene los
pocillos completamente y los aspire eficientemente después de 30
sec. (líquido remanente: < 15 µl).
IT: Después del lavado, %&G35&%. &0. 0UK1,/3. %&G*(&()&. invirtiendo
los micropocillos sobre papel absorbante.
1 ,5
7
1
0 ,5
0
0
50
100
150
" 3 ( + & ( ) % * ) ,- ( ./ & .! " # .X : 2 ] 0Z
200
250
<&^&%&(+,*'
1. Kosasa T. S., Measurement of Human Chorionic Gonadotropin, Journal of
Reproductive Medicine 26, 201-6 (1981)
2. Danzer H. et al., Maternal Serum Human Chorionic Gonadotropin
Concentrations and Fetal Sex Predictions, Fertility and Sterility 34, 336-40
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Normal Pregnancy, American Journal of Obstetrics and Gynecology 126, 67881 (1976)
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Measurements as an Aid to the Diagnosis of Early Pregnancy Disorders,
American Journal of Obstetrics and Gynecology 131, 25-32 (1978)
EL-HCG
INF 5304001 E
06-2004-14
!
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