FONDECYT
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Concurso Nacional de Proyectos FONDECYT 2005 *** COMPROBANTE DE RECEPCION DE INFORME FINAL NUMERO RESPONSABLE :JULIO CESAR TAPIA PINEDA RUT :10739461-3 TIPO :POSTDOCTORADO ETAPA :2006 3050037 DURACION : 2 A-no(s) TITULO : EL SUPRESOR DE TUMORES CAVEOLINA-]. INTERACTUA CON LA CICLOOX IGENASA-2 E INHIBE SU ACTIVIDAD CATALITICA, PROMOVIENDO LA A DISCIPLINA :BIOLOGIA CELULAR (BIOLOGIA 2) FECHA RECEPCION :02/04/2007 FONDECYT TIMBRE RECEPCION INFORME FINAL GOBIERNO DE CHILE PROYECTO FONDECYT POSTDOCTORADO FONDECVT 3050037 2 AÑOS SEGUNDO AÑO NÚMERO PROYECTO DURACIÓN AÑO DE EJECUCIÓN TAPIA PINEDA 10.739,461-3 ANDREW QUEST 14,672.243-1 INVESTIGADOR POSTDOCTORADO RUT INVESTIGADOR PATROCINANTE RUT jtapia@med.uchile.cl 9786706 aguest@med.uchile.cl 7382015 JULIO E-mail E-mail FONO FONO [ab. Comunicaciones Celulares, Facultad de Medicina, Av Independencia 1027, Santiago DIRECCION INV. POSTDOCTORADO PERIODO QUE INFORMA 31 / marzo / 2006 31 / marzo / 2007 DESDE HASTA CONTENIDO (MARQUE ELCASILLERO QUE CORRESPONDA) FUE ENVIADO NO HAY AD)UNTO (FECHA) SERA ENVIADO (FECHA) Informe Final (en formulario) Publicaciones Presentaciones a Congresos Evaluación del Investigador Patrocinante Otros (especificar)^S IN Firma Investigador Patrocinante Firma Investigador Posdodorado Fecha. ?7 / CONTENIDO DEL INFORME FINAL I. CUMPLIMIENTO DE LOS OBJETIVOS PLANTEADOS EN EL PROYECTO. Objetivos 1. Determinar que la reexpresión ectópica de Cav-1 en células de adenocarcinoma de colon inhibe una de las hemireacciones catalizadas por la COX-2 2. Definir el dominio específico de Cav1 involucrado en la inhibición de COX-2 y analizar su interacción con esta enzima, así como la formación de otros complejos macromoleculares 3. Generar clones estables en células de adenocarcinoma de colon con las mutantes de Cav-1 en su dominio de interacción-inhibición de COX-2 y analizar con estas mutantes, o un péptido Sintético del dominio de interacción, el rol in situ de COX-2 en la promoción de la sobrevivencia de estas células frente a situaciones de estrés 4. Definir los mecanismos que contribuyen a la estabilización de la proteína -catenina en células tumorales y su relación con la mayor expresión de genes importantes en proliferación celular y resistencia a la apoptosis, como COX-2 y survivina Si ¿Cumplido? Parcial No E E E E E E E E Fundamentación para el cumplimiento parcial o incumplimiento En células de cáncer de colon l-1T29(US) la expresión ectópica de Cav-1 WT inhibe a COX-2 medida por un ensayo de actividad peroxidasa. En estas células ocurre sólo este tipo de regulación post- transcripcional, puesto que en otras la Cav-1 también regula la cantidad de mRNA de COX-2 a nivel transcripcional. Se encontró algunos residuos cercanos al dominio putativo tipo-WW de Cav-1 que están involucrados en la inhibición de la actividad enzimática de COX-2. No obstante, no se pudo determinar la interacción entre ambas proteínas por métodos tan sensibles como MALDI-TOF/TOF ni se pudo identificar otras proteínas que se asocien o interactúen con Cav-1. Se generaron clonesestabsdeCav-1 WT y mutantes que permitieron definir que el dominio tipo-WW está involucrado en la inhibición de COX-2 a nivel post-transcripcional en células HT29(US). Se analizó también el rol de COX-2 en la sobrevida de células de distintos tipos de cáncer. Sin embargo, no se estudió el efecto de Cav-1 WT (o mutantes en dominio tipo-WW) en la modulación de la resistencia a la apoptosis. Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de los objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos. En primer lugar, se agradece al Consejo la buena acogida a nuestra propuesta de incorporación de un objetivo adicional debido a los problemas que se explicaron en el informe anterior. No obstante, durante el segundo año del proyecto se intentó cumplir con los tres primeros objetivos planteados, obteniéndose resultados interesantes que prontamente serán enviados a publicación. Pero sin duda los resultados más importantes están relacionados con el objetivo adicional que, a nuestro juicio, permiten darlo como cumplido por cuanto se estableció un mecanismo que aplica tanto para células normales como tumorales, donde la actividad transcripcional de l-catenina es fundamental en la expresión de genes blanco, como survivina y COX-2, y que normalmente están relacionados con la modulación de la sobrevida y resistencia a la apoptosis (ver figura 8 de sección Resultados). Es así como, hemos definido en nuestro laboratorio que las proteínas CK2 y Caveolina-1 funcionan de manera opuesta sobre la regulación de la actividad transcripcional de -catenina promoviendo o reprimiendo sobrevida celular, respectivamente. Estos resultados han sido aceptados favorablemente en la comunidad científica internacional y han podido ser publicados en revistas de gran prestigio como Journal of Ce!! Science y Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA. Por lo tanto, en el desarrollo de este proyecto se ha mostrado una capacidad de superación de los problemas inherentes a toda investigación, lo cual ha sido respaldado por publicaciones en excelentes revistas internacionales. II. RESULTADOS Describa brevemente los resultados obtenidos en el proyecto en un máximo de cinco páginas, tamaño carta, espacio seguido. Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione las publicaciones y/o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. Incluya en anexos la información de apoyo que estime pertinente y necesaria para la evaluación. Objetivo 1. Determinar que la reexpresión ectópica de Cav-1 en células de adenocarcinoma de colon inhibe una de las hemireacciones catalizadas por la COX-2. Objetivo 2. Definir el dominio específico de Cav-1 involucrado en la inhibición de COX-2 y analizar su interacción con esta enzima, así como la formación de otros complejos macromoleculares. En el informe anterior se mostró que la expresión ectópica de Cav-1 silvestre (clones C14 y C16) en células metastásicas de cáncer de colon HT29(US) tuvo un efecto inhibidor de la actividad enzimática de COX-2 (ie, a nivel post-transcripcional) pero no sobre sus niveles de mRNA (ie, a nivel transcripcional), como ocurrió en las células embrionarias HEK-293T. Además, en estas mismas células la expresión de la doble mutante de Cav-1 en los residuos Trp-128 y Pro-132 del dominio tipo-WW no tuvo efecto sobre COX-2 a nivel transcripcional, mientras que células HT29(US) expresando Cav-1 con las mismas mutaciones (ie, clon C37) mostraron un bloqueo de la inhibición de la actividad de COX-2 por Cav-1. En consecuencia, se intentó definir más detalladamente los residuos del dominio tipo-WW de Cav-1 que están involucrados en la regulación transcripcional y post-transcripcional de COX-2, para lo cual se generó la mutación W98F correspondiente al otro triptofano que define al dominio. Similarmente a lo observado con la mutante Cav1Wl2S'l32G en células HEK-293T y HT29(US), la mutación del residuo Trp-98 condujo a una reducción en los niveles de mRNA de COX-2 sólo en células embrionarias HEK-293T y parecida a la observada con Cav-1 silvestre (figura lA). Por el contrario, la expresión ectópica de la misma Cav-1 mutante (clon C56) en células de cáncer de colon HT29(US) no tuvo un efecto significativo sobre la actividad enzimática de COX-2 (figura iB). En consecuencia, estos resultados sugieren que el dominio-tipo WW de Cav-1 conformado por los residuos Trp-98, Trp-128 y Pro-132 no estaría participando en la regulación negativa de COX-2 a nivel transcripcional en células HEK-293T, mientras que en células de cáncer de colon HT29(11S) este dominio sólo estaría regulando la actividad enzimática a un nivel post-transcripcional. A NT Mock WT W98F W128F1P132G B COX-2 80 o 60 40 t 20 mock c14 c37 c56 Figura 1. Cav-1 regula negativamente a actividad de COX-2 a nivel post-transcripcional. (A) RT- PCR para la expresión de cox-2 en células HEK293T transfectadas transitoriamente con el vector pLacIOP vacío (mock) o conteniendo los cDNAs de Cav-1 silvestre (WT) y mutantes W98F y W128F/P132G. NT indica no transfectadas. (B) Ensayo de actividad porcentual de COX-2 (cayman Corp) en clones de HT29(US) que expresan ectópicamente el vector vacío (mock) o las formas de Cav-1 silvestre (C14), W128F/P132G (C37) y W98F (c56). En todos los casos se indujo la expresión de Cav-1 silvestre y mutantes con 1 mM IPTG. Objetivo 3. Generar clones estables en células de adenocarcinoma de colon con las mutantes de Cav-1 en su dominio de interacción-inhibición de COX-2 y analizar con estas mutantes, o un péptido sintético del dominio de interacción, el rol in situ de COX-2 en la promoción de la sobrevivencia de estas células frente a situaciones de estrés. En el informe anterior se mostró el diseño de las formas Cav-1 wT y Cavlwl2&'l32G, su expresión transitoria en células embrionarias HEK-293T o estable en células de cáncer de colon HT29(US) y se analizó su efecto en la regulación transcripcional y post-transcripcional de COX-2. Por consiguiente, se estudió el rol in situ de COX-2 en la sobrevida y resistencia a la apoptosis de distintos tipos celulares. En primer lugar se analizó el efecto del inhibidor específico "COX-2 Inhibitor II" (Calbiochem) en la proliferación y resistencia a la apoptosis en células de cáncer de colon (HT29, DLD1), mama (ZR75) y embrionarias (HEK-293T). Los resultados mostraron que el nivel de actividad enzimática de COX-2 es determinante sobre los niveles de proliferación y apoptosis medidos en estas células, puesto que en general una mayor actividad de COX-2 (figura 2A) se correlaciona con una mayor sensibilidad a la muerte por apoptosis (figura 2B). Asimismo, se observó también una cierta tendencia de las células a tener una menor capacidad proliferativa (figura 2C). Interesantemente, estos resultados mostraron que células que poseen una mayor actividad enzimática de COX-2 (y probablemente también una mayor expresión) son más susceptibles a la muerte producida por un inhibidor específico. Esto también indica que células que expresan ectópicamente Cav-1 silvestre debiesen ser menos resistentes a la muerte por apoptosis, aunque durante este proyecto ese aspecto no fue abordado. B 4T2OiUS) DLD1 ZR75 HEK 100 41T20(US) DLD1 ZRHS 4444294)5) HEE 01.04 D415 04,4, Figura 2. La actividad de COX-2 es importante en la regulación de la sobrevida celular. (A) Ensayo de actividad específica de COX-2 en células de cáncer de colon (HT29[US] y DLD1), mama (ZR75) y embrionarias (HEK-293T) crecidas en presencia de un inhibidor específico de COX-2. (B) Apoptosis medida por citometría de flujo de células tratadas como en A y teñidas con yoduro de propidio. Se muestra las veces de aumento de la apoptosis con respecto al control sin inhibidor. (C) Proliferación medida por ensayo MTS (Promega) de las células tratadas como en A. Se muestra el promedio de al menos tres ensayos con p : 5 0.01. Objetivo 4. Definir los mecanismos que contribuyen a la estabilización de la proteína 3-catenina en células tumorales y su relación con la mayor expresión de genes importantes en proliferación celular y resistencia a la apoptosis, como COX-2 y survivina. Este objetivo adicional fue propuesto en el informe anterior debido a que nuestros resultados mostraron que la regulación post-transcripcional de COX-2 por Cav-1 (ie, inhibición de la actividad enzimática) ocurría solamente en células metastásicas de cáncer de colon HT29(US), mientras que en las demás células analizadas, como HEK-293T, DLD-1, ZR-75 e incluso HT29(ATCC), estaba ocurriendo una regulación a nivel transcripcional (ie, disminución de niveles de mRNA y proteína) no sólo de COX-2 sino también de la proteína inhibidora de la apoptosis Survivina. Además, encontramos que la proteína kinasa CK2 participa positivamente en la regulación de la expresión de COX-2 y survivina en células HT29(US) a través de un mecanismo mediado por la proteína íl-catenina, actuando en estas células como un factor promotor de la proliferación y de resistencia a la apoptosis. Los datos mostraron que inhibiendo CK2 con un inhibidor específico, TBB, en células HT29(US) o expresando transitoriamente la subunidad cx en HEK-293T se observaba la disminución y aumento, respectivamente, de los niveles proteicos de COX-2 y survivina. Por lo tanto, para entender mejor el mecanismo dependiente de í-catenina que da cuenta de la regulación transcripcional de COX-2 y survivina, se estudió el efecto de la expresión ectópica de Cav-1 silvestre sobre la expresión de COX-2 en distintos tipos de células. Se produjo clones estables de Cav-1 silvestre en líneas celulares de cáncer de colon (HT29-US y DLD-1) y mama (ZR75), así como se expresó transitoriamente la misma en células no cancerosas (HEK-293T) y se analizó los niveles de mRNA y proteína de COX-2. Se observó que Cav-1 regula negativamente los niveles de mRNA de COX-2 y survivina en las células DLD-1, ZR75 y HEK-293T (figura 3). Estos resultados están relacionados con los publicados recientemente por nuestro grupo con respecto a la regulación de la expresión de la proteína inhibidora de la apoptosis Survivina (ver anexo Torres V.A. et al. J. Ceil Sci. 2006 119:1812-23) y en su conjunto permiten postular un mecanismo de regulación de la progresión celular y resistencia a la apoptosis por parte de Cav-1, donde esta proteína impediría la transcripción de genes blanco de la ruta 1-catenina-Tcf/Lef, como COX-2 y survivina (ver esquema de figura 8). IPTG DLDI - + ZR75 - + HEK - + Figura 3. Cav-1 regula la expresión de COX-2 cox-2 RT-PCR de células transfectadas con el vector de expresión pLacIOP-Cav-1 y crecidas en ausencia (-) o oresencia (+) de !PTc. y survivina a nivel transcripcional. survivina = - - actina Si bien este mecanismo ocurre en varios tipos celulares cancerosos (como DLD1 y ZR75) y no cancerosos (como HEK-293T y NIH-3T3) e incluso en la línea celular de cáncer colorectal HT29(ATCC), sorprendentemente no es funcional en la sublínea metastásica HT29(US) (figuras 4A y 4B). Para explicar esta diferencia, se analizó en ambas líneas celulares de HT29 el nivel de expresión y localización subcelular de E-cadherina, una proteína típicamente relacionada con í-catenina y con función supresora de tumores. Se observó que, a diferencia de las células HT29(ATCC), en la variante metastásica HT29(US) el nivel de expresión de E-cadherina fue muy bajo y la mínima cantidad se acumuló en parches discretos en el interior y no en la superficie celular (figura 4C). A IPTG mock Cav-1 - + - + B caveolin-1 survivin mock Figura 4. La regulación de la expresión de genes blanco de /I-catenina-Tcf/Lef por Cav-1 es dependiente de E-cadherina. (A) Western Cav.1 IPTG - + - + caveolin-1 blot donde se muestran los niveles proteicos de caveolina-1, survivina y actina en células HT29(ATCC) transfectadas con vector vacío pLacIOP (mock) o conteniendo el cDNA de caveolina-1 silvestre (cav-1), ambos crecidos en ausencia (-) o presencia (+) de 1 mM IPTG. (B) Western blot de células HT29(IJS) tratadas en las mismas condiciones de A. (C) en células Niveles E-cadherina de HT29(ATCC) HT29(US) detectados y mediante microscopía confocal de fluorescencia. Se muestra la localización de E-cadherina (verde) y los recuadros muestran una ampliación de la zona marcada con flechas donde el núcleo aparece teñido con yoduro de propidio (rojo). survivin - actin acti n ji. HT29(ATCC) HT29(uS) Similarmente a lo que ocurre en la línea HT29(ATCC) que expresa normalmente E-cadherina en su superficie, la reexpresión de E-cadherina en células HT29(US) devolvió a éstas la habilidad de Cav-1 para regular negativamente a survivina y también de reducir la proliferación celular (figura 5A y 5B), consecuentemente con un aumento en la coi nmunoprecipitación (figura 5C) y colocalización (no mostrado) entre Cav-1 y l-catenina. Adicionalmente, Cav-1 y E-cadherina cooperaron en la represión de la transcripción dependiente de ll-catenina-Tcf/Lef en células HEK-293T (figura 5D). Por lo tanto, la regulación negativa de la expresión de survivina e inhibición de la proliferación mediada por caveolina-1 en células rnetastásicas requiere de la presencia de E-cadherina, mientras que su ausencia compromete severamente la habilidad de Cav-1 para actuar como un supresor de tumores (estos resultados han sido enviados a la revista Molecular Ceil Biology para su publicación). E-cadhenn A Mork Figura S. La presencia de E-cadherina devuelve a las células HT29(US) la capacidad de regular negativamente la expresión de survivina. (A) Western blot donde se muestran los niveles proteicos de Cav-1, survivina y actina en células HT29(US) transfectadas con vector vacío pLacIOP (mock) o conteniendo el cDNA de caveolina-1 silvestre (Cav-1), ambos crecidos en ausencia (-) o presencia (+) de 1 mM IPTG (comparar con figura 4B). (B) Proliferación medida por ensayo MTS de células HT29(US) expresando o no Cav-1 y en ausencia o presencia de E-cadherina, según leyenda al pie de figura. (C) Ensayo de inmunoprecipitación (IP) utilizando anticuerpo anti-Cav-1 de las mismas células marcadas con barras achuradas en B y visualización de la asociación de Ecadherina o 3-catenina en un WB. (D) Ensayo de actividad transcri pcional de (3-catenina mediante reportero de luciferasa en las mismas células en B. Donde se indica, el asterisco indica un valor estadístico de p 0.001. 100 H cav-1 75 IPTG - + - + Caveolin-1 50-4 - 25-1 survivin Caveolin-1 actin - + - + - c E-cadherin * D it' caveoiin.i ! b loo-. 75. .: !; 1::: Ecadhenn 13-catenin caveoiin-1 - 6 caveolin-1 - - + + E-cadherin - + - + Por el contrario, resultados anteriores sugieren que la proteína kinasa CK2 es importante en la sobrevida de las células tumorales debido a que regula positivamente la expresión de genes involucrados en progresión del ciclo celular y de resistencia a la apoptosis, como survivina y COX-2. El estudio de la regulación de la expresión de survivina mediante distintas estrategias experimentales como: (i) utilizando inhibidores específicos de la actividad de la proteína kinasa CK2, como TBB y DMAT, en células de distintas líneas de cáncer; (II) eliminando la expresión de la subunidad CK2u mediante siRNA en células embrionarias HEK-293T; y (iii) sobreexpresando transitoriamente la subunidad o en células HEK-293T; permitió definir que esta enzima es otro componente importante en el mecanismo de regulación de la actividad transcripcional de la proteína 13-catenina, actuando esencialmente de modo opuesto a caveolina-1 (ver esquema de figura 8), y teniendo un rol primordial en la viabilidad de las células tumorales. Estos resultados fueron recientemente publicados en la revista Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (ver anexo Tapia J.C. et al. PNAS 2006 103:15079-84). Puesto que la inhibición de CK2 con TBB tuvo un efecto negativo en la expresión de COX-2 en células HT29(US) así como la expresión ectópica de la subunidad CK2u produjo un aumento en los niveles de mRNA y proteína para COX-2 en células HEK-293T (informe anterior), se utilizó el inhibidor más específico para CK2, DMAT, y se analizó su efecto en la expresión de COX-2 y resistencia a la apoptosis en células de distintas líneas de cáncer. Como se esperaba, la inhibición de CK2 con DMAT tuvo un severo efecto en la expresión de COX-2 a nivel de mRNA y proteína en células de cáncer de colon y mama (figura 6). DMAT 011)1 HT29ATCC) HT29(U5) + ZR-75 COX-2 cm HT29(ATCC) HT29(US DMAT - - + - - DLD-1 + -.-- ZR-75 - Figura 6. La proteína kinasa CK2 regula positivamente la expresión de survivina y COX-2 a nivel transcripcional. (A) RT-PCR de células crecidas en ausencia + o presencia (+) de 40 (B) WB de las mismas células mostradas en A. pM DMAT. actin - Asimismo, los niveles de apoptosis en las mismas líneas de cáncer fueron incrementados en presencia del inhibidor DMAT aunque en grado distinto dependiendo del tipo celular (figura 7A). Interesantemente, la diferencia de apoptosis observada entre células fue bastante similar a la que se midió cuando se utilizó un inhibidor específico de COX-2 (figura 75). Considerando que el nivel de actividad enzimática de COX-2 influye en la viabilidad y apoptosis de distintas células (ver figura 2), estos resultados sugieren que la diferencia de apoptosis entre células se relaciona con la diferencia en los niveles de expresión de COX-2 producto de la regulación diferencial de la actividad transcripcional de 3-catenina por la proteína kinasa CK2. Por consiguiente, asumiendo que existe una conexión entre COX-2 y survivina, como se ha sugerido recientemente (Krysan K. et al. 2004 Faseb J. 18:206-8), la presencia de CK2 en la célula tumoral parece ser importante para mantener elevados niveles de COX-2 y survivina, los que a la postre le proporcionan una ventaja por sobre otras debido a que la proteína kinasa CK2 promovería una mayor proliferación y resistencia a la apoptosis. A B 5 2j 1T9iATCCi HT29(USI OLDI ZP-75 +IT29iATCC1 -1T29(US1 0101 ¿R75 Figura 7. La diferencia de apoptosis entre distintas células es un reflejo de la diferencia en los niveles de expresión de COX-2 debido a la regulación diferencial de la actividad transcripcional de /1-catenina por la proteína kinasa CK2. Apoptosis medida por citometria de flujo en células crecidas en presencia de un inhibidor especifico de CK2, DMAT (A), o de un inhibidor de COX-2 (B) y teñidas con yoduro de propidio. Se muestra las veces de aumento de la apoptosis con respecto al control sin inhibidor. Finalmente, los resultados obtenidos en este proyecto pueden ser resumidos en el modelo que aparece en la figura 8, donde se muestra los distintos componentes que interactúan funcionalmente para regular la expresión de proteínas, como survivina y COX-2, involucradas en la sobrevida y resistencia a la apoptosis en células de cáncer de colon y Otros. Figura 8. Caveolina-1 y CK2 modulan la sobrevida y resistencia a la apoptosis en células tumorales. El esquema muestra que dentro de la célula la actividad transcripcional de l-catenina es fundamental en la expresión de genes blanco, como survivina y COX-2, los cuales modulan la sobrevida y resistencia a la apoptosis. De esta forma, CK2 y Cav-1 funcionarían de manera opuesta en la regulación de la actividad de -catenina promoviendo o reprimiendo sobrevida celular, respectivamente. III. PRODUCTOS GENERADOS POR EL PROYECTO En esta sección debe incluir todo documento o material cuyo contenido corresponda substancialmente a los objetivos del proyecto que se informa y en los que se explicite el N° del proyecto FONDECYT. Aténgase a los formatos que se incluyen para cada tipo de producto generado. Sólo adjunte copia de los documentos no enviados previamente a FONDECYT. 1. Artículos en revistas científicas nacionales o extranjeras con Comité Editorial. Título del Artículo Caveolin-1 controis celi proliferation and celi death by suppressing expression of the inhibitor of apoptosis protein Survivin Autor(es) Torres VA., Tapia J.C., Rodríguez D.A., Párraga M., Lisboa P., Montoya M., Leyton L. y Quest A.E.G. Nombre Completo de la Revista. Journal of Ce!! Science Ref. bibliográfica Estado de la publicación a la fecha." Otras fuentes de financiamiento, si las hay N° Pág. 1812-23 0 Publicada/En Li Aceptada LI Enviada LI En preparación Prensa FONDAP 15010006, WellcomeTrust WT064911/Z/01/Z, ICGEB CRP/CH102- 01, FIRCA 1-R03-TW06024-01, Fondecyt 1040390 Título del Artículo Casein kinase 2 (CK2) increases survivin expression via enhanced í-cateninT ceil factor/lymphoid enhancer binding factor-dependent transcription Autor(es) Tapia J.C., Torres V.A., Rodriguez D.A., Leyton L., and Quest A.E.G. Nombre Completo de la Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA Ref. bibliográfica Estado de la publicación a la fecha.* Otras fuentes de financiamiento, si las hay Año: Revista. Año: 2006 2006 Vol. 119 Vol. 103 N° 41 Pág. 15079-84 E2 Publicada/En E Aceptada - Li Enviada E En preparación Prensa FONDECYT 1040390, ICGEB CRP/CH102-01, Eogarty-NIH #R03TW00602403, FONDAP 15010006, Wellcome Trust WT064911/Z/01/Z Título del Artículo Caveolin-1-mediated down-regulation of survivin and inhibition of cell proliferation in metastatic cancer cells requires E-cadherin expression Autor(es) Torres VA, Tapia JC, Lladser A, Rodríguez DA, Leyton L. and Quest AFG. Nombre Completo de la Revista. Molecular CefI Bio!ogy Ref. bibliográfica Año:-- 2007 Vol. ______ N° _______ Pág. Estado de la publicación a LI Publicada/En LI Aceptada 1121 Enviada la fecha.* Prensa Otras fuentes de FONDAP 15010006, FONDECYT 1040390 financiamiento, si las hay 9 - E En preparación Título del Artículo Protein kinase CK2 promotes tumor ceil viability via transcriptional upregulation of cyclooxygenase -2 Autor(es) Tapia )C, Lladser A, Rodríguez DA, Hernández JG, Leyton L. and Quest AFG. Nombre Completo de la Journal of Biological Chemistry Ref. bibliográfica Año: Revista. 2007 Vol. N° Pág. Estado de la publicación a E la fecha.* Otras fuentes de financiamiento, si las hay E Enviada Publicada/En E Aceptada En preparación Prensa FON DECYT 1040390, Fogarty-NIH R03TW006024-03, ICGEB CRP/CH102-01, FONDAP 15010006 Título del Artículo Caveolin-1 reduces cyc1ooxygenase-2 (COX-2) expression transcriptiorial mechanism involving the I-catenin-Tcf/Lef pathway Autor(es) Rodríguez DA, TapiaJC, Torres VA, Leyton L and Quest AFG Nombre Completo de la Revista. j7jnai of Celi Science Ref. bibliográfica Año: 2007 Vol. N° Estado de la publicación a E Publicada/En E Aceptada la fecha.* Prensa Otras fuentes de financiamiento, si las hay via a Pág. E Enviada 1151 En preparación FONDECYT 1040390, FONDAP 15010006 - Marque con una "X" lo que corresponda. Para trabajos Publicados/En Prensa/Aceptados/Enviados adjunte copia de carta de aceptación o de envío. ID] 3. Presentaciones a Congresos Nacionales e Internacionales. Adjunte copia del resumen o texto de la ponencia y de la tapa de/libro de Resúmenes, si no la ha enviado previamente. Título de la Ponencia Autor(es) Protein kinase CK2 promotes ceil survival in cancer celis by a mechanism involving enhanced ;-catenin-Tcf/Lef dependent transcription of the inhibitor of apoptosis protein Survivin Tapia .J., Torres y ., Leyton L., and Quest A.E.G. Nombre del Congreso International Symposium Mechanisms of Ceil Death: Molecular Insights and Therapeutic Perspectives País: Chile Ciudad: Reñaca Fecha: 13-16 Abr, 2005 Lugar y Fecha Título de la Ponencia Autor(es) Caveolin-1 down-regulates the expression of the IAP protein survivin via a transcriptional mechanism involving the l-catenin-Tcf/Lef pathway Torres y ., Tapia J., Leyton L. and Quest A.F.G. Nombre del Congreso International Symposium Mechanisms of Ceil Death: Molecular Insights and Therapeutic Perspectives País: Chile Ciudad: Reñaca Fecha: 13-16 Abr, 2005 Lugar y Fecha Título de la Ponencia Caveolin-1 down-regulates expression of survivin via inhibition of fl-catenin____________________ Tcf/Lef-dependent transcription Autor(es) Torres V., Tapia )., Leyton L. and Quest A.F.G. Nombre del Congreso International Meeting Biosciences 2005: From Genes to Systems Lugar y Fecha País: United Kingdom Título de la Ponencia Protein kinase CK2 mediated ceIl survival is linked to enhanced expression of the inhibitor of apoptosis protein Survivin Tapia J.C., Torres V.A., Rodriguez DA., Leyton L. and Quest A.E.G. Autor(es) Ciudad: Glasgow Fecha: 17-21 Jul, 2005 Nombre del Congreso 45f" Annual Meeting of The American Society for CelI Biology Lugar y Fecha País: United States of Ciudad: San Francisco America Título de la Ponencia Caveolin-1 down-regulates the expression of the inhibitor of apoptosis protein survivin via a transcriptional mechanism involving the p-catenin-Tcf/Lef pathway Torres V., Tapia J., Rodriguez D., Leyton L., Quest A.F.G. Autor(es) F echa: 10-14 Dic, 2005 Nombre del Congreso Keystone Symposia. Connecting the Scientific Community (Lipid Rafts and CelI Funtion) País: United State of Ciudad: Colorado Fecha: 23-28 Mar, 2006 Lugar y Fecha America Título de la Ponencia Autor(es) Protein kinase CK2 increases cyclooxygenase-2 (COX-2) expression vía a transcriptional mechanism involving the í-catenin-Tcf/Lef pathway Tapia JC, Rodríguez DA, Torres VA, Leyton L., Quest A.F.G. Nombre del Congreso XX Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile Lugar y Fecha País: Chile Título de la Ponencia E-cadherin facilitates caveolin-1-rnediated down-regulation of survivin and inhibition of cell proliferation Torres y ., Tapia 3., Lladser A., Rodríguez D., Leyton L., Quest A.F.G. Autor(es) Ciudad: Pucon - Fecha: 8-12 Oct, 2006 Nombre del Congreso XX Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile País: Chile Lugar y Fecha Ciudad: Pucon [Fecha: 8-12 Oct, 2006 Título de la Ponencia Caveolin-1 reduces cyclooxygenase-2 (COX-2) expression via a transcri ptional mechanism involving the í3-catenin-Tcf/Lef pathway Autor(es) Rodriguez DA, Tapia )C, Torres VA, Leyton L., Quest A.F.G. Nombre del Congreso 1 XX Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile Lugar y Fecha 1 País: Chile Ciudad: Pucon 1 Fecha: 8-12 Oct, 2006 Título de la Ponencia E-cadherin promotes the anti-proliferative role of caveolin-1 as well as down____________________ regulation of survivin Autor(es) Torres V.A., Tapia 3., Lladser A., Rodriguez D., Leyton L. and Quest A.F.G. Nombre del Congreso 46 th Annual Meeting of The American Society for CelI Biology Lugar y Fecha País: United America States of Ciudad: San Diego 12 Fecha: 9-13 Dic, 2006 IV. OTROS LOGROS DEL PROYECTO. Describa, si las hay, actividades tales como: • Estadías de investigación • Cualquier otro logro no contemplado en los ítems anteriores y que Ud. quiera destacar. Se realizó una estadía en el laboratorio del Dr. Jay W. Heinecke, Proteomics Core, Mass Spectrometry Resource, Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine, University of Washington, Seattle, USA. Este laboratorio posee los más modernos equipos que existen actualmente para hacer investigación en el área de la Proteómica, como MALDI-TOF/TOF, ESI, etc. Posteriormente, se ha mantenido una comunicación contínua con el Dr. Heinecke, lo cual implica una colaboración así como la realización de futuras estadías del investigador responsable o alumnos de doctorado. La experiencia ganada en el área de la Proteámica se ha aplicado en diversas líneas de investigación en nuestro laboratorio y en otros que conforman el Centro Fondap de Estudios Moleculares de la Célula (CEMC). La asistencia a la 45 1' Reunión Anual de la Sociedad Americana de Biología Celular (ASCB) en San Francisco, USA, fue de gran utilidad para los propósitos de este proyecto, puesto que además de conocer las líneas de investigación de vanguardia en biología celular sirvió para contactar a algunos investigadores con quienes se pudo y podrá colaborar. El primer ejemplo es el Dr. Timothy Hla (Director, Center for Vascular Biology, Health Center, University of Connecticut) quien es un reconocido investigador en el área de la ciclooxigenasa-2 y nos envió el plásmido pOSM1--cox-2 que fue utilizado en experimentos para determinar que: (i) la regulación transcripcional y post-transcripcional de COX-2 es dependiente de Cav-1 '' 13-catenina; (u) la expresión ectópica de COX-2 aumenta la resistencia a la apoptosis en células de cáncer de colon; y (iii) la reversión de la muerte debido a la expresión ectópica de COX-2 en células tratadas con inhibidores específicos de CK2 es consecuencia del incremento de la estabilidad de survivina. Asimismo, se estableció el contacto con la Dra. Odile Filhol-Cochet (INSERM, Grenoble, Francia) quien está dispuesta a recibir al investigador responsable o algún tesista de doctorado en el ámbito de colaboración relacionada con la nueva línea de investigación que se pretende continuar (párrafo siguiente). El último logro a mencionar está relacionado con el novedoso mecanismo descrito para explicar la función anti-apoptótica de la proteína kinasa CK2 y su rol en la resistencia a la muerte inducida por drogas en células de cáncer de colon. Considerando que esta kinasa está frecuentemente sobreexpresada e hiperactiva en distintos tipos de cáncer, nos propusimos ampliar nuestros descubrimientos a otras líneas tumorales, con resultados positivos. Así, este mecanismo de resistencia a la apoptosis mediado por CK2 y dependiente de la actividad transcripcional de f-catenina-Tcf/Lef es funcional en distintos tipos celulares normales y tumorales. Estos resultados llevaron a que el investigador responsable ideara una nueva línea de investigación relativa al estudio del mecanismo molecular que da cuenta de la regulación de la estabilidad de l-catenina por parte de CK2, lo cual se planteará en un proyecto Fondecyt de Iniciación. Finalmente, debido a los logros científicos del investigador responsable es que el Centro FONDAP de Estudios Moleculares de la Célula le ha otorgado la posición de Investigador Asociado y el respaldo institucional en términos de infraestructura y honorarios para continuar con la investigación propuesta. En el mismo contexto, el investigador está trabajando como Coordinador del curso de Biología Celular para las carreras de Obstetricia y Puericultura en la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, a la espera de que prontamente sea incluido a la planta de académicos. 13 V. INFORME DE EVALUACION DE INVESTIGADOR PATROCINANTE NOMBRE: i.tV El proyecto de post-doctorado desarrollado por el Dr. Julio Tapia en mi laboratorio fue formulado originalmente en el estudio de la regulación post-transcripcional de COX-2 por la proteína supresora de tumores Caveolina-1 en células de cáncer de colon. Si bien no pudimos cumplir con todos los objetivos específicos planteados, durante el segundo año de ejecución se avanzó en todos ellos de manera considerable, con resultados que sin duda serán prontamente publicados en buenas revistas internacionales (dos manuscritos en preparación) El problema surgido al comienzo de este proyecto debido a que la inhibición de la actividad peroxidasa de COX-2 por Cav-1 se debía también a la regulación negativa de su expresión a través de un mecanismo dependiente de -catenina, nos condujo a estudiar más profundamente y en distintos tipos celulares, normales y tumorales, el mecanismo de regulación positiva de la expresión de survivina, una proteína inhibidora de la apoptosis y sobreexpresada en la mayoría de los cánceres. Este cambio de rumbo en la línea de investigación del proyecto fue una muy buena decisión por cuanto pudimos delinear un mecanismo para explicar la regulación de COX-2 y survivina en células tumorales (especialmente en HT29) donde Caveolina-1 y la proteína kinasa CK2 actuarían de manera opuesta promoviendo o impidiendo apoptosis, respectivamente. Parte fundamental en este mecanismo lo constituye la proteína kinasa CK2, la cual promueve un aumento de la actividad transcripcional de 3-catenina y un incremento de la expresión de ambas proteínas, COX-2 y survivina, ambas relacionadas con una mayor resistencia de las células cancerosas a la muerte inducida por drogas quimioterapeuticas. Así, se describió por primera vez el carácter anti-apoptótico de la proteína kinasa CK2 a través de la regulación de la estabilidad de -catenina y la consecuente mayor expresión de proteínas involucradas en proliferación y sobrevida, como COX-2 y survivina, lo cual le valió a estos resultados ser publicados en la revista Proceeding of the Nationa/ A ca clem y of Scien ces of the USA. Por otro lado, un avance importante también relacionado con este proyecto fue haber definido que el mecanismo de regulación de la expresión de COX-2 y survivina por caveolina-1 ocurre en la mayoría pero no en todas las células, ya que en células metastásicas derivadas de cáncer de colon, HT29(US), o de melanoma murino, BL16-F1O, este mecanismo no funciona. Esto nos condujo a obtener resultados muy interesantes que muestran que la regulación negativa de la expresión de survivina e inhibición de la proliferación mediada por caveolina-1 en células metastásicas requiere de la presencia de E-cadherina, mientras que su ausencia compromete severamente la habilidad de Cav-1 para actuar como un supresor de tumores (manuscrito enviado a la revista Molecular Ce!! Biology). En conclusión, evalúo muy positivamente la investigación realizada por el Dr. Tapia, por cuanto ha avanzado en todos los objetivos específicos propuestos pese a las dificultades encontradas. Justamente el desarrollo de la capacidad de superar las dificultades que se encuentre en el camino y desarrollar nuevas ideas exitosas lo veo como una parte esencial en la formación de un post-doctorado. Su trabajo ha llevado ya a dos publicaciones en revistas de muy buen nivel y seguramente serán por lo menos tres más (1 en revisión y 2 en preparación), por lo que al término del año 2007 el Dr. Tapia debiese contar con 5 publicaciones en muy buenas revistas internacionales como resultado de su periodo de post-doctorado en mi laboratorio. Esto representa un muy buen rendimiento. Además, el Dr. Tapia supo aprovechar las posibilidades que le ofreció contar con un proyecto para aprender nuevas técnicas (incluyendo espectrometría de masas) que le sirven para el desarrollo de proyectos como investigador independiente en el futuro cercano. El excelente desempeño del Dr. Tapia en mi laboratorio ha conducido a su afiliación al Centro FONDAP-CEMC como un investigador joven asociado y se espera luego contar con su incorporación al ICBM como académico, donde ya ha asumido responsabilidades en docencia coincidente con dicha proyección. Firma Investigador Patrocinante Fecha: OJS 14 - VI. RESUMEN (NO DEBE EXCEDER ESTE ESPACIO EN LETRA ARIAL 10) Describa en forma precisa y breve el tópico general del proyecto, sus metas y objetivos y los resultados alcanzados. Utilice un lenguaje apropiado para la comprensión del público no especialista en el tema. Esta información podrá ser difundida. El cáncer es una de las principales causas de muerte en Chile y a nivel mundial. Dentro de las neoplasias, el cáncer de colon es una de las más frecuentes y su etiología se ha asociado con cambios genéticos y con diversos factores ambientales o epigenéticos. Caveolina-1 (Cav-1) es una proteína integral de membrana de 21-24 kDa y componente principal de las caveolas e interactúa, a través de ciertos dominios específicos (de andamiaje y tipo-WW), con un gran número de proteínas que participan en distintas rutas de señalización, muchas de ellas involucradas en proliferación celular. Debido a que la interacción de estas proteínas con Cav-1 generalmente conduce a su inactivación, se ha sugerido que caveolina-1 funcionaría como un supresor de tumores. Por otro lado, los niveles de proteína y actividad de COX-2 (una enzima que regula la síntesis de prostaglandirias y que está asociada con resistencia a la apoptosis) están aumentados en células de cáncer colorectal. Esto se ha descrito como un evento epigenético que promueve la formación de tumores. En nuestro laboratorio, el análisis estructural de COX-2 determinó que esta proteína tendría algunos dominios involucrados en la interacción con Cav-1 (CBD), así como resultados preliminares mostraron que su actividad pero no su expresión es inhibida por la reexpresión de Cav-1 en células HT29. Por consiguiente, la hipótesis de este proyecto fue que "La proteína supresora de tumores Cav-1 inhibe a COX-2 a través de interacciones que involucran su dominio de andamiaje y/o su dominio tipo-WIV, favoreciendo así la apoptosis en células de adenocarcinoma de colon". Mediante el diseño de clones estables que expresan Cav-1 silvestre o mutantes en células de cáncer de colon HT29, se demostró que el dominio tipo-WW está relacionado con la capacidad de Cav-1 de regular negativamente a COX-2 a nivel post-transcripcional (ie, inhibición de su actividad enzimática). No obstante, este efecto se observó sólo en la variante metastásica de cáncer colorectal, HT29(US), puesto que en células embrionarias de riñón (HEK-293T), cáncer de mama (ZR75), cáncer colorectal (DLD1) e incluso en la línea parental HT29(ATCC), se observó además una regulación negativa de la expresión de COX-2 a nivel transcripcional (le, mRNA). La regulación negativa de la expresión de COX-2 por Cav-1 fue similar a lo que ocurrió con la proteína anti-apoptótica Survivina, la cual junto con COX-2 constituye un blanco conocido de la ruta canónica de señalización de Wnt, cuyo componente principal es la proteína coactivadora de la transcripción -catenina. Se analizó entonces la posibilidad de que Cav-1 pudiera regular negativamente la expresión de COX-2 y survivina por medio de la inhibición de la actividad transcripcionai de 3-catenina. En efecto, nuestros resultados mostraron que Cav-1 regula negativamente la actividad transcripcional de 13catenina, lo cual conlleva a una disminución de los niveles de mRNA y proteína para COX-2 y survivina y, consecuentemente, a una mayor predisposición de las células normales y cancerosas a la apoptosis inducida por drogas quimioterapeúticas. Los resultados anteriores nos llevaron a estudiar el rol anti-apoptótico de la proteína kínasa CK2, puesto que había sido descrito que estabiliza a (3-catenina de la degradación proteasomal, es decir, actuaría esencialmente de manera opuesta a Cav-1 Mediante el uso de inhibidores específicos, transfección con vectores que expresan la subunidad catalítica CK2o (o mutante inactiva) y la inhibición de su expresión con siRNAs específicos, se estableció que la proteína kinasa CK2 regula positivamente la actividad transcripcional de 13-catenina y, consecuentemente, la expresión de sus genes blanco, como COX-2 y survivina, los cuales están involucrados en promover sobrevida y resistencia a la apoptosis. Por lo tanto, hemos definido un mecanismo de regulación de la sobrevida en células normales y tumorales donde CK2 y caveolina-1 funcionan de manera opuesta. La proteína kinasa CK2 actúa como un factor anti-apoptótico promoviendo la expresión de COX-2 y survivina por medio del aumento de la actividad transcripcional de 13-catenina. En cambio, Cav-1 tiene un rol pro-apoptótico (consecuente con su labor como supresor de tumores) disminuyendo la actividad transcripcional de 13-catenina y así la expresión de sus genes blanco, y con la consiguiente disminución de la viabilidad celular. 15
