RapiFluor

[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLIC ANOS ]
La nueva generación para
la preparación y análisis de
muestras de N-glicanos
[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS
[ SOLUCIONES
DE GLICANOS
PARA
] EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
Integración de técnicas complementarias
para simplificar el análisis de glicanos
Waters ofrece métodos completos basados en el flujo de trabajo para analizar glicoproteínas a todos los niveles
estructurales.
¡ Obtención de perfiles de glicoproteínas
¡ Monitorización y caracterización de glicanos liberados
¡ Análisis de subunidades
¡ Composición de monosacáridos
Complejidad del método
¡ Mapeo de glicopéptidos
ANÁLISIS DE
GLICANOS
LIBERADOS
COMPOSICIÓN DE
MONOSACÁRIDOS
MAPEO DE
GLICOPÉPTIDOS
ANÁLISIS DE
SUBUNIDADES
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
INTACTAS
Aumento de la información
3
2
¿Qué ocurriría si
el análisis de N-glicanos liberados estuviese
optimizado y fuese sumamente sensible?
Por fin, un flujo de trabajo inteligente sin renunciar
a nada.
5
[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLIC ANOS ]
Flujo de trabajo para el análisis de proteínas intactas
GLICOPROTEÍNA
Patrón de
comprobación de masa
de mAb intacto
INYECCIÓN EN COLUMNA
PARA EL ANÁLISIS POR LC
ANÁLISIS POR LC
CON DETECTOR TUV
CONFIRMACIÓN DE
MASA CON QTof MS
Cartucho de desalado MassPREP™ o columna
ACQUITY UPLC ® BEH C 4 de 300 Å, mezcla
de patrones de proteínas MassPREP
y kit de análisis de masa intacta
Sistemas ACQUITY UPLC
Xevo ® G2-XS QTof MS
SYNAPT® G2-Si HDMS
Flujo de trabajo para el análisis de subunidades
GLICOPROTEÍNA
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA IdeS
CON REDUCCIÓN OPCIONAL
Patrón de
comprobación de masa
de mAb intacto
INYECCIÓN EN COLUMNA
PARA EL ANÁLISIS POR LC
ANÁLISIS POR LC
CON DETECTOR UV
Columna ACQUITY UPLC
Protein BEH C 4 de 300 Å
Sistemas Alliance ® HPLC o
ACQUITY UPLC
Flujo de trabajo para el mapeo de glicopéptidos
GLICOPROTEÍNA
Patrón de
comprobación de masa
de mAb intacto
REDUCCIÓN, ALQUILACIÓN,
Y DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
INYECCIÓN EN COLUMNA
PARA EL ANÁLISIS POR LC
ANÁLISIS POR LC
CON DETECTOR TUV
Fragmentos de péptidos
glicosilados y no glicosilados
Columna de fase reversa o
BEH Amide de Waters
Sistemas ACQUITY UPLC
Flujo de trabajo para la composición de monosacáridos
GLICOPROTEÍNA
LIBERACIÓN DE
MONOSACÁRIDOS
Hidrólisis con ácido
3
MARCAJE CON UN
FLUORÓFORO
Inyección en columna
para el análisis por LC
Columna ACQUITY UPLC BEH
C18, 130 Å, 1,7 μm,
2,1 x 100 mm
[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
Software UNIFI ® y
MassLynx ®
G1F/G2F
PROCESAMIENTO
DE DATOS
2000
2500
3000
m/z
3500
147700
148000
Espectro ESI-TOF MS de un mAb
148300
148600
G2F/G2F
G0F/G1F
G0F/G0F
+48
+54
G1F/G1F, G0F/G2F
Resultados
+51
148900
masa
149200
Espectro ESI-TOF MS deconvolucionado
Resultados
Fc/2 + glicanos
0,24
CONFIRMACIÓN DE MASA
CON QTof MS
PROCESAMIENTO
DE DATOS
Xevo G2-XS QTof MS
SYNAPT G2-Si HDMS
Software MassLynx
A 214
0,18
Fd’
LC
0,12
0,06
0,00
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 min
Resultados
A
Ampliación x 6
MS
(Intensidad
pico base)
B
Glicopéptidos
MAPEOS DE PÉPTIDOS
CON QTof MS
PROCESAMIENTO
DE DATOS
Xevo G2-XS QTof
SYNAPT G2-Si HDMS
Software MassLynx y UNIFI
Ampliación x 4
UV a 280 nm
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45 min
Resultados
50
45
40
35
1. N-acetilglucosamina (GlcNAc)
2. N-acetilgalactosamina (GalNAc)
3. Galactosa (Gal)
4. Manosa (Man)
5. Glucosa (Glc)
6. Fucosa (Fuc)
3
4 5
30
PROCESAMIENTO
DE DATOS
Sistemas Alliance HPLC o
ACQUITY UPLC
Software Empower ® 3
6
25
EU
Análisis por LC
con detector FLR
2
20
15
10
1
5
0
-5
10
15
20
25
30 min
5
[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
MONITORIZACIÓN DE RUTINA
Explore las posibilidades
Gracias al aumento de la eficacia de la ionización y a la mayor afinidad de protones de RapiFluor-MS, por fin
es posible realizar la detección de masas de glicanos con el detector ACQUITY QDa.
¡ Ofrece una sensibilidad inigualable para la detección por FLR y MS.
¡ Ofrece una mayor confianza en la confirmación de masa de picos de FLR.
¡ Reduce la duración de los análisis cromatográficos con la obtención dirigida de perfiles de glicanos por MS
para conseguir un rápido desarrollo del proceso.
¡ Se puede integrar con facilidad con los flujos de trabajo de UPLC para el cumplimiento de las GMP con el
software Empower 3.
Monitorización de glicanos con el sistema ACQUITY UPLC H-Class Bio y con detección FLR y ACQUITY QDa
FLR
EU
480
240
0
10
15
20
25
MS
3,2x10 6
Intensidad
30 min
1,6x106
0
10
15
20
25
30 min
Monitorización de N-glicanos marcados
con RapiFluor-MS mediante un sistema
ACQUITY UPLC H-Class Bio configurado
con un detector por fluorescencia FLR y con
un detector de masas ACQUITY QDa para
la confirmación de estructuras conocidas
y obtención de datos de masa de picos sin
asignar.
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[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
Presentación del kit de N-glicanos GlycoWorks RapiFluor-MS
Waters, líder en innovaciones diseñadas para los análisis bioterapéuticos, ha reinventado el flujo de trabajo para
el análisis de N-glicanos liberados. Nuestro nuevo reactivo, RapiFluor-MS,™ cuenta con la capacidad de ionización
necesaria para maximizar la información generada por la detección de MS. Nuestro nuevo flujo de trabajo acelera la
deglicosilación y simplifica el marcaje.
Se trata del flujo de trabajo inteligente que estaban esperando los laboratorios biofarmacéuticos. Ya no tendrá que
elegir entre una herramienta de marcaje “rápida” y la sensibilidad de la espectrometría de masas; no habrá más
procesos complicados que requieren mucho trabajo y que dejan poco margen de error.
Con Waters, no hay compromisos entre la velocidad y la sensibilidad en la preparación de muestras, ya que
simplemente obtendrá resultados analíticos más fiables.
Únase a la forma de ver las cosas de Waters
en el análisis de glicanos liberados
RESULTADOS POR MS
VELOCIDAD/PRODUCTIVIDAD
CUANTIFICACIÓN POR FLR
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[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
¿Cómo funciona?
El análisis de N-glicanos liberados es una técnica que proporciona
una gran cantidad de información, pero que implica procedimientos
de preparación de muestras complicados. Una vez que los glicanos se
liberan con PNGase F, es necesario realizar el marcaje para conseguir
una detección y una separación eficaces. Al utilizar el nuevo protocolo
de Waters, ahora cuenta con un flujo de trabajo versátil para:
¡ Identificación de glicanos
GLICOPROTEÍNA
N-GLICANOS
LIBERADOS
¡ Estructura de glicanos
¡ Monitorización de glicanos
GLICOPROTEÍNA
N-GLICANOS
LIBERADOS MEDIANTE
DEGLICOSILACIÓN
Patrón de
comprobación de masa
de mAb intacto
Rapid PNGase F y solución
tampón de GlycoWorks™,
y surfactante RapiGest™ SF
INYECCIÓN EN COLUMNA
PARA EL ANÁLISIS POR LC
0,0E+0
1,2E+6
0,0E+0
FLR
10
12
14
16
Placas o cartuchos
GlycoWorks HILIC µElution
ANÁLISIS POR LC
CON DETECTOR FLR
CARACTERIZACIÓN O
CONFIRMACIÓN DE MASA
Sistemas Alliance HPLC o
ACQUITY UPLC
Detector ACQUITY® QDa ®
Xevo G2-XS QTof MS
SYNAPT G2-Si HDMS
18
20
22
24
26
28
30 min
MS
10
Marcaje con
GlycoWorks
RapiFluor-MS
GLICANOS PURIFICADOS
Columna BEH Amide para glicanos,
patrón para pruebas de rendimiento
de glicanos y escalera de calibración
Dextran
1,2E+6
GLICANOS
MARCADOS
Resultados
PROCESAMIENTO
DE DATOS
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30 min
Software UNIFI,
MassLynx y Empower
Descubra la ciencia que se esconde tras nuestro NUEVO REACTIVO GlycoWorks RapiFluor-MS, que
cuenta con nuevas posibilidades para la caracterización, la monitorización y el análisis de glicanos. Vea
nuestro vídeo en waters.com/SeeT heScience.
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[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
¿Qué ocurriría si la preparación de muestras de N-glicanos liberados
fuera rápida y sencilla?
¡ Prepare rápida y fácilmente las muestras marcadas de N-glicanos liberados.
¡ Reduzca los errores y evite gastar más muestra.
¡ Forme fácilmente a los analistas y transfiera los métodos a toda su organización.
3 PASOS, 30 MINUTOS
GLICOPROTEÍNA
Patrón de
comprobación de masa
de mAb intacto
N-GLICANOS LIBERADOS
GLICANOS MARCADOS
GLICANOS PURIFICADOS
Rapid PNGase F y solución
tampón de GlycoWorks™, y
surfactante RapiGest SF
Marcaje con GlycoWorks
RapiFluor-MS
Placas o cartuchos
GlycoWorks HILIC µElution
PASO 1
PASO 2
PASO 3
< 15
minutos
5
minutos
10
minutos
Vea un breve vídeo de demostración de
dos minutos sobre el kit de N-glicanos
RapiFluor-MS.
www.waters.com/RapiFluorMS
8
[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
¿Qué ocurriría si pudiese obtener una sensibilidad de FLR y MS incomparable?
¡ Mejore su comprensión de la calidad del producto con una caracterización detallada de picos no identificados
anteriormente por medio de la cuantificación por fluorescencia obtenida con una respuesta por espectrometría de masas
equivalente.
¡ Acelere la toma de decisiones.
¡ Identifique con mayor facilidad los N-glicanos poco abundantes.
SENSIBILIDAD SIN IGUAL
Fluorescencia
Marcaje con RapiFluor-MS
O
N
O
NH
100
90
90
80
80
N
NH
40
30
a*
id
AB
m
na
tá
an
st
in
ai
a
ne
S
r-
m
na
ai
0,6
2-
0,1
M
AB
2-
tá
an
AB
in
st
Fl
Ra
pi
NH
ne
S
M
r-
N
uo
NH
Glicano
1000X 160X
10
0
0
O
a
Marcaje con procainamida
20
7,0*
7,0
10
oc
14X
20
Respuesta por espectrometría
de masas 160 veces mayor y
fluorescencia 14 veces mayor
en comparación con marcajes
tradicionales (2-AB y
procainamida). Respuesta
por espectrometría de masas
1000 veces mayor y fluorescencia
2 veces mayor en comparación con
marcajes instantáneos.
Pr
30
NH2
O
3X
30,0*
AB
NH
40
uo
Glycan
50
Fl
Marcaje con 2-AB
60
52,5
50
pi
NH
oc
NH
70
2X
60
Ra
NH2
O
Glycan
70
a*
O
id
Marcaje instantáneo con AB
Pr
NH
Respuesta relativa (%)
Glicano
MS (intensidad del pico base)
100
*Basado en valores teóricos publicados.
Descubra cómo puede aportar posibilidades
extraordinarias a sus análisis cotidianos.
www.waters.com/XevoG2XS
9
[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
¿Qué ocurriría si los datos de masa estuviesen siempre fácilmente
disponibles para los análisis de glicanos rutinarios?
¡ Aumente su confianza en la monitorización de los perfiles de glicanos con la detección de masas rutinaria.
¡ Obtenga información sobre los cambios de fabricación con un menor tiempo por muestra.
¡ Solucione rápidamente los problemas con la transferencia y el desarrollo de métodos.
CONFIANZA
Detalle del perfil de N-glicanos de un mAb
1,2E+6
0,0E+0
1,2E+6
0,0E+0
FLR
10
12
14
16
18
20
22
10
12
14
16
18
20
22
Vea un breve vídeo de un minuto que le
explicará cómo puede incorporar toda la
potencia de la detección de masas a su
laboratorio.
www.waters.com/QDa
10
24
26
28
30 min
MS
24
26
28
30 min
El aumento de la eficacia de la ionización
de RapiFluor-MS permite emparejar la
fluorescencia cuantitativa con la detección
de masas que se lleva a cabo con el detector
ACQUITY QDa.
[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
Información para pedidos
Kits completos de preparación de muestras
Descripción
N.º ref.
Kit básico de N-glicanos GlycoWorks RapiFluor-MS
El kit contiene: módulo de deglicosilación GlycoWorks, módulo de marcaje GlycoWorks, módulo de
limpieza GlycoWorks, módulo de recogida de muestras GlycoWorks, columna ACQUITY UPLC Glycan
BEH Amide de 1,7 μm y 2,1 x 150, concentrado de fase móvil: formiato de amonio
176003635
Kit de N-glicanos GlycoWorks RapiFluor-MS
El kit contiene: módulo de deglicosilación GlycoWorks, módulo de marcaje GlycoWorks,
módulo de limpieza GlycoWorks, módulo de recogida de muestras GlycoWorks
176003635
176003606
176003606
Patrones y accesorios
Descripción
Cantidad
N.º ref.
Escalera de calibración RapiFluor-MS Dextran
50 μg/vial
186007982
400 pmol total/vial
186007983
Solución de formiato de amonio para análisis de glicanos
—
186007081
Cuñas para el sistema de extracción de vacío
—
186007986
Pieza de separación del sistema de extracción de vacío
con presión positiva para el kit de N-glicanos
GlycoWorks RapiFluor-MS
—
186007987
Patrón para pruebas de rendimiento de glicanos RapiFluor-MS
Seminario “Lunch & Label”
Aprenda cómo marcar glicanos durante el descaso para comer
¿Quiere ver cómo el kit de N-glicanos RapiFluor-MS y el detector de masas ACQUITY
QDa pueden mejorar sus análisis de glicanos ? Permita que se lo mostremos con
un seminario realizado a la hora de comer en sus instalaciones. Para obtener más
información o programar un seminario “Lunch & Label”,
visite waters.com/GlycansForLunch.
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[ SOLUCIONES PARA EL ANÁLISIS DE GLICANOS ]
La nueva generación del marcaje de glicanos
Reactivo RapiFluor-MS
Creado a partir de la experiencia de Waters en el marcaje
rápido por fluorescencia de aminoácidos, RapiFluor-MS está
diseñado con propiedades químicas mejoradas para lograr un
análisis de glicanos superior. En una reacción de cinco minutos,
O
O
RapiFluor-MS modifica las glicosilaminas generadas por la
N
liberación enzimática de una glicoproteína.
O
NH
O
N
NH
MS
Marcaje de carga
de amina terciaria
O
¡ Marcaje rápido
Rápido
¡ Fluorescencia eficaz
Grupo de marcaje rápido
de carbamato de NHS
¡ Respuesta por espectrometría de masas sin igual
N
Fluorescencia
Fluoróforo de quinolinil
GlycoWorks RapiFluor-MS
CARACTERIZACIÓN
Asigne componentes de glicanos presentes en baja concentración
con más facilidad y fiabilidad
Consiga niveles sin precedentes para las asignaciones estructurales con sensibilidad
de MS y MS/MS al combinar RapiFluor-MS con los extraordinarios espectrómetros de
masas Xevo G2-XS QTof y SYNAPT G2-Si HDMS.
Caracterización de glicanos mediante UPLC® FLR con el espectrómetro de masas Xevo G2-XS QTof
1130,9423, 2+
1: TOF MS ES+
FA2G2Ga1BPI
6.93e6
2-AB convencional
Glicano obtenido a partir de 10 µg
de proteína
Preparación de muestra: 1,5 días
Fucosa
GlcNAc
Manosas
Galactosa
1: TOF MS ES+
BPI
6.93e6
800
RapiFluor-MS
1600 m/z
Glicano obtenido a partir de 0,1 μg
de proteína
Preparación de muestra: <1 hora
5,5
12
10,0
15,0
20,0
25,0 min
Comparación del cromatograma de
LC-MS de N-glicanos marcados con
2AB frente a N-glicanos marcados
con RapiFluor-MS de los mismos
mAb. Se ha observado una respuesta
de ESI+ MS 100 veces superior para
muestras marcadas con RapiFluor-MS.
Un espectro de MS (inserto) muestra el
espectro sumado para un glicano poco
abundante dentro de la muestra.
OFICINAS DE VENTAS:
Austria 43 1 877 18 07
Australia 61 2 9933 1777
Bélgica y Luxemburgo 32 2 726 1000
Brasil 55 11 4134 3788
Canadá 1 800 252 4752
China 86 21 6156 2666
República Checa 420 2 617 11384
Dinamarca 45 46 59 8080
Finlandia 358 9 5659 6288
Francia 33 1 30 48 72 00
Alemania 49 6196 400 600
Hong Kong 852 2964 1800
Hungría 36 1 350 5086
India 91 080 49292200 03
Irlanda 353 1 448 1500
Israel 9723 3731391
Italia 39 02 265 0983
Japón 81 3 3471 7191
Corea 82 2 6300 9200
México 52 55 52 00 1860
Países Bajos 31 76 508 7200
Noruega 47 6 384 6050
Polonia 48 22 101 5900
Portugal 351 21 893 61 77
Puerto Rico 1 787 747 8445
Rusia/CEI 7 495 727 4490 / 336 7000
Singapur 65 6593 7100
www.waters.com/glycans
España 34 93 600 9300
Suecia 46 8 555 115 00
Suiza 41 56 676 7000
Taiwán 886 2 2508 5500
UAE 971 4 214 62 38
Reino Unido 44 208 238 6100
Estados Unidos 1 800 252 4752
Waters Corporation
34 Maple Street
Milford, MA 01757 EE. UU.
Tel.: 508 478 2000
Fax: 508 872 1990
www.waters.com
Waters, T he Science of W hat’s Possible, ACQUITY UPLC, UPLC, Alliance, ACQUITY, QDa, UNIFI, SYNAPT,
Empower, Xevo, MassPREP y MassLynx son marcas comerciales registradas de Waters Corporation.
RapiFluor-MS, GlycoWorks y RapiGest son marcas comerciales de Waters Corporation.
©2015 Waters Corporation. Impreso en EE. UU.
Febrero de 2015 720005271ES K P-SIG