Criopreservación de embriones

CRIOPRESERVACIÓN DE
EMBRIONES
Dr. Rafael Aragunde Vieytes
Asistente de clase Grado 2
Teriogenología
Orden de la Clase
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Introducción
Ventajas y desventajas
Crioprotectores
Congelación convencional
Vitrificación
Comentarios
Introducción
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Definición: Es el proceso mediante el
cual logramos que los embriones cambien
de estado físico; de estar en un medio
líquido, a uno sólido
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Historia:
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En el año ‘72 – 1ª congelación exitosa (ratón)
En el año ‘73 – Wilmut y Rowson informan una
preñez lograda por embrión congelado bovino
Ventajas y desventajas
Ventajas
Almacenamiento
Programas
Comercio Nacional e
Internacional
Tiempo
Progreso genético
Transporte
Control de
enfermedades
Desventajas
Técnica costosa
Baja tasa de Preñez
Requiere
entrenamiento
No todo es congelable
Conceptos básicos
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Embrión es 80% agua
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Cristalización de agua=Muerte
embrionaria.
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Efecto Solución=Muerte embrionaria
Crioprotectores
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Definición: Son sustancias que
previenen la formación de cristales de
agua intracelulares.
Clasificación
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Permeables de bajo peso molecular: DMSO,
glicerol, etilenglicol, propilenglicol.
No permeables:
-de bajo peso molecular: Sucrosa,
trealosa, glucosa, rafinosa.
-de alto peso molecular:
polivinilpirrolidona, alcohol
polivinílico y
otros polímeros.
Clasificación de métodos
Estándar
En equilibrio
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De un paso
Transferencia Directa
Criopreservación
Rápida
Sin equilibrar
Vitrificación
Criopreservación
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Método convencional
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Proceso de deshidratación lento y
controlado durante la disminución de
temperatura.
Métodos alternativos
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Vitrificación: Se logra el grado máximo
de deshidratación antes del
enfriamiento y la disminución de
temperatura es brusca.
Ventajas y Desventajas
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Metodo convencional:
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Vitrificación
Selección de embriones a congelar
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En estadios de Mórula, Blastocisto.
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De calidades excelentes o buenas
Clasificación:
Clasificación:
Clasificación:
Metodo Convencional
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PBS-Glicerol 1,36 M(10%)
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Glicerol 0,4 M hasta equilibrio 5´
Glicerol 0,8 M hasta equilibrio 5´a 10´
Glicerol 1,36 M 10´
Cargamos el embrión
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Pajuelas de 0,25 ML.
Etapas de congelación y descongelación
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Exposición del embrión a crioprotectores
permeables a temperatura ambiente
hasta que se alcance un equilibrio molar.
Inducción de formación de cristales o
seeding.
Descenso lento y controlado.
Nitrógeno líquido.
Descongelación en baño maría 25ºC.
Remoción de crioprotector a temperatura
ambiente.
Transferencia.
Seeding:
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Inducción de cristales de hielo.
Calor latente de fusión.
Evitar fenómeno de súperenfriamiento.
El aumento de temperatura existe
pero es mas tenue.
Congelación convencional
Descongelación del embrión
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Baño María de 20Cº a 27Cº
Extracción de Crioprotector
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Glicerol 0,5 M hasta equilibrio 6´
Glicerol 0,3 M hasta equilibrio 6´
PBS suero isotónico.
Cargado de pajuela 0.25
Transferencia
Método de Leibo
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Se extrae el Glicerol dentro de la
pajuela.
Se congela una columna contra el
tapón de PBS sucrosa al 1,08M y en
la otra el embrión con PBS glicerol
1,5M.
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Baño Maria
Se mezclan las columnas 20´
Hidratación en el útero
Método de transferencia directa
(Etilenglicol)
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Clasificación de embriones (solo bueno y muy
buenos).
Lavado de embriones.
Colocar embriones en soluciones 1,5 M de
etilenglicol (5-10 Minutos).
Colocar las pajuelas en la máquina de
congelación (-5 a -7 ºC) 2 minutos.
Seeding
Curva de 0,6 ºC/min hasta -35 ºC.
N2
Pajuela en Transferencia directa
Vitrificación
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Concentraciones multimolares.
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Glicerol
Etilenglycol
1-2 propanadiol
Ficoll
Toxicidad
Comentarios
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Aspecto laboral
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Centros
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Importación
GRACIAS!!!!
Bibliografía

G. A. Palma & G. Brem. “Transferencia
de embriones y biotecnología de la
reproducción en la especie bovina”.
Edit. Hemisferio Sur

Rodolfo Ungerfeld. “Reproducción en
los animales domésticos”. Tomo II.
Melibea Ediciones

Aragunde, R y otros. “Manual práctico
de transferencia de embriones bovinos”.
Fac. de Veterinaria. Octubre, 2000