PROTOCOLOS ACTUALES DE CONGELACIÓN: ¿QUÉ Y CÓMO

PROTOCOLOS ACTUALES DE
CONGELACIÓN:
¿QUÉ Y CÓMO CONGELAR?
María Teresa Cañete Reina
E.S.H.R.E. Senior Clinical
Embryologist
Embryocenter Sevilla
CRIOPRESERVACIÓN
-CONGELACIÓN DE GAMETOS Y
EMBRIONES A MUY BAJA
TEMPERATURA:-80ºC A -196ºC
-DISMINUCIÓN FUNCIONES VITALES
-CONDICIONES DE VIDA
SUSPENDIDAS
-REACCIONES BIOQUÍMICAS
DETENIDAS
-CONGELACIÓN Y ALMACENAMIENTO
CONGELACIÓN
LOS EMBRIONES NO TRANSFERIDOS para uso posterior por:
-fallo de embarazo
•
-segundo hijo
TODOS LOS EMBRIONES por:
-condiciones maternales adversas.
•
INDICADA PARA:
RETRASO MATERNIDAD por causas laborales ó sociales
•
PACIENTES ONCOLÓGICAS (quimioterapia ó radioterapia)
•
PACIENTES NO ONCOLÓGICAS ( tratamientos gonadotóxicos)
•
CIRUGÍA REPETITIVA EN EL OVARIO COMO ENDOMETRIOSIS
-RIESGO DE SHO
•
BANCO DE ÓVULOS
-APARICIÓN PÓLIPOS ENDOMETRIALES
-HIDROSÁLPINX
•
POSPONER TRANSFERENCIA POR:
-AUSENCIA DE ESPERMATOZOIDES
-DIFICULTAD DE RECOGER LA MUESTRA
DÍA DE PUNCIÓN
-PACIENTES CON BAJA RESPUESTA PARA
ACUMULAR OVOCITOS (DGP)
•
CONGELACIÓN LENTA
DAÑOS:
-CONGELACIÓN INTRACELULAR Y FORMACIÓN DE CRISTALES
-EFECTOS NOCIVOS DE LA SOLUCIÓN EN MEMBRANA CELULAR Y
ORGÁNULOS CELULARES POR CONCENTRACIÓN DE ELECTROLITOS
FASES DEL PROCESO DE
CONGELACIÓN:
-PRECONGELACIÓN
-CONGELACIÓN
-ALMACENAMIENTO
PRECONGELACIÓN: Exposición
y equilibrio a un crioprotector.
Los crioprotectores modifican
las propiedades físicas de una
solución por bajar su punto de
congelación.
TIPOS DE CRIOPROTECTORES
•
PERMEABLES ó INTRACELULARES: Bajo peso molecular
-Glicerol (G)
-Dimetilsulfóxido (DMSO)
-1,2 propanodiol
-Etilenglicol (EG)
-Propilenglicol (PG),
-Polietilenglicol (PEG)
-Etanol y otros alcoholes
FUNCIÓN
-Entran en la célula
-Reemplazan el agua intracelular
-Modifican características fisicoquímicas y respuesta frente al
descenso de temperatura
MECANISMOS DE ACCIÓN:
-Disminución punto de congelación
de la suspensión.
-Impiden formación de hielo
CRIOPROTECTORES
•
IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso molecular
-Polivinilpirrolidona (PVP)
-Glucosa
-Fructosa
-Ficol
-Dextrano
-Sorbitol
-Sucrosa
-Lactosa
-Trealosa, Rafinosa y otros azúcares
FUNCIÓN
-Reducen agua intracelular por efecto osmótico
USO DE CRIOPROTECTORES EN
EMBRIONES
•
PRONÚCLEOS: Propanodiol y sacarosa
•
4-8 CÉLULAS: Dimetilsulfósido
•
BLASTOCISTO: Glicerol
FASES CONGELACIÓN
Pasos:
•
CONGELACIÓN
1EQUILIBRIO DE TEMPERATURAS entre la cámara de
enfriamiento y el embrión
2ENFRIAMIENTO LENTO hasta llegar al punto de equilibrio
de la congelación por debajo de la cual está la NUCLEACIÓN
o formación primer cristal de hielo (-5ºC a -15ºC)
3SUPERENFRIAMIENTO:Diferencia entre el punto de
equilibrio y nucleación.
-Cristalización espontanea del medio
-Aumento de la temperatura debido al
desprendimiento de calor latente
- Se puede bajar por “SEEDING” físico inducido cerca
del punto de equilibrio aprox 2ºC por
debajo pto
congelación
•
ALMACENAMIENTO
SEEDING :INDUCCIÓN NUCLEACIÓN
-CERCA DELPUNTO DE EQUILIBRIO APROX 2ºC POR DEBAJO PTO CONGELACIÓN
-TOCAR PARED EXTERIOR TUBO MUESTRA DONDE ESTÁ EMBRIÓN CON PINZAS
PREENFRIADAS.
-ENFRIAMIENTO DE LA SOLUCIÓN LOCALMENTE A UNA TEMPERATURA POR
DEBAJO DE -20ºC
NUCLEACIÓN ESPONTANEA
-EMBRIÓN COMO OSMÓMETRO Y SE DESHIDRATA.
•
•
PLANER KRYO 10 serie II versión
1.7para aprox 16 embriones
UNIDAD DE SEEDING AUTOMÁTICA
MODULO PELTIER TERMOELÉCTRICO que actúa como bomba de calor
•
SUPERENFRIAMIENTO LOCAL
•
INDUCCIÓN A LA NUCLEACIÓN
NICOOL MS21
SEEDING MANUAL
VITRIFICACIÓN
CARACTERÍSTICAS
-
-
-
-
ENFRIAMIENTO MUY RÁPIDO
SOLUCIÓN ALTAMENTE
CONCENTRADA QUE NO
CRISTALIZA DURANTE LA
CONGELACIÓN
SU VISCOSIDAD AUMENTA CON EL
DESCENSO DE TEMPERATURA
HASTA LA FORMACIÓN DE UN
ESTADO SÓLIDO AMORFO
VOLUMEN MÍNIMO DE MEDIO
(MENOS DE 0,1 MICROLITROS)
VITRIFICACIÓN ESPERMATOZOIDES
VITRIFICACIÓN:VENTAJAS
•
•
•
•
No hay cristalización del embrión.
Utiliza altas concentraciones de crioprotector que disminuye
el período de exposición del embrión a éstos.
El uso de pequeños volúmenes provee un incremento
significativo en la tasa de enfriamiento.
Tasas de enfriamiento entre 15.000 y
30.000ºC/min(0,3ºC/min en la congelación lenta)
•
Se minimizan el daño por cambios osmóticos.
•
Se reduce el tiempo del procedimiento (2-10´).
•
Protocolo muy sencillo.
•
Se eliminan los costos de adquisición de equipos.
•
USO DE LAS DOS TÉCNICAS EN
EMBRYOCENTER
Congelación lenta: Embriones en estadío de
desarrollo de día 1.
•
Vitrificación: desde ovocitos hasta
embriones en cualquier estadio de desarrollo
(desde día 2 hasta blastocisto).
MI EXPERIENCIA EN CONGELACIÓN
LENTA/ VITRIFICACIÓN
PUBLICACIÓN EN
AÑO 1990 EN
REVISTA para
pacientes
PUBLICACIÓN EN BOLETÍN
INFORMATIVO
VITRIFICACIÓN EN TRIPLOIDES.
M.T. Cañete, M. Esbert, E. Moreno, C. Martinez.C.I.V.T.E. (Centro de Inseminación in Vitro y
Transferencia Embrionaria) Sevilla
INTRODUCCIÓN: La vitrificación en triploides es un método de congelación en el que, debido a la alta concentración de crioprotectores y ultrarrápida velocidad de enfriamiento, cuando se congela
el sistema embrión-medio, las moléculas se disponen de manera similar a las del vidrio (tiene igual disposición molecular e iónica que el líquido), solidificando sin formación de cristales de
hielo;ésta tiene ventajas frente a la congelación tradicional, pero el principal problema para la aplicación a gran escala ha sido el control estricto del tiempo de exposición de los embriones al
crioprotector, ya que debido a la alta concentración requerida del mismo, existen problemas de disminución de la viabilidad embrionaria.
Un buen crioprotector debe tener alta solubilidad y baja toxicidad a altas concentraciones y, si es penetrante, bajo peso molecular para entrar fácil y rápidamente a la célula y obtener el
máximo efecto protector.Para que los crioprotectores no penetrantes expresen al máximo sus carcterísticas deben ser mezclados con crioprotectores penetrantes.
CRIOPROTECTORES
ALTO PESO MOLECULAR
PENETRANTES
-
NO PENETRANTES
Ficoll, Polivinilpirrolidona, etc...
BAJO PESO MOLECULAR
Glicerol, Etilenglicol, etc..
Sacarosa, trehalosa, etc...
OBJETIVO: Probar el método de vitrificación en triploides para ver la viabilidad de éstos y poderlos aplicar en la práctica clínica. MATERIAL Y MÉTODOS: Se emplearon 15 embriones en día +2 procedentes de zigotos triploides.Estos se expusieron secuencialmente a las soluciones de vitrificación que llevaban etilenglicol como
crioprotector intracelular o penetrante, trehalosa como crioprotector extracelular o no penetrante de bajo peso molecular, para la deshidratación de las células, y hialuronato, crioprotector
macromolecular para incrementar la viscosidad.
Se usaron pajuelas de congelación convencionales de 0.3 ml rellenadas con 30-50 microlitros de la gota de solución de vitrificación con los embriones.
Los embriones se almacenaron en nitrógeno líquido durante 30-60 minutos, y se descongelaron rápidamente en un baño a 37 grados centígrados.El contenido de las pajuelas se llevó a un medio
tamponado con Hepes suplementado con 0.3 M de sacarosa.
RESULTADOS: 13 (86%) de los 15 embriones triploides preservaron una morfología normal en todas las blastómeras y no mostraron signos de daño tras la descongelación; 1 embrión (7%) tuvo una
sola blastómera dañada combinada con 3-5 blastómeras supervivientes; 1 embrión (7%) tuvo viabilidad en menos de la mitad de sus células.12 embriones (80%) incluyendo el embrión con una sola
blastómera dañada continuaron con la división celular.
7%
7%
86%
EM BRIONES NO DAÑADOS
EMBRIONES DAÑADOS
EM BRIONES MUY DAÑADOS
CONCLUSIÓN: El método de vitrificación con hialuronato podría ser un eficiente y simple método de criopreservación en embriones humanos.
VITRIFICACIÓN EN TRIPLOIDES
HIALURONATO
MEDIOS DE
VITRIFICACIÓN/DESVITRIFICACIÓN
VITRI
-Basic Solution (BS): 1 X 1.5ml vial (only for Oocyte
Vitrification)
-Equilibration Solution (ES): 1 X 1.5ml vial
-Vitrification Solution (VS): 2 X 1.5ml vials
1 Cryotop stores up to 5 Oocytes or 4 Embryos as a
recommendation.
Composition
・ HEPES within Basic
Culture Medium
・ Ethylene Glycol
・ DimethylSulfoxide
・ Trehalose
・ Hydroxypropyl
Cellulose
DESVITRI
- Thawing Solution (TS): 2
x 4.0ml
-Diluent Solution (DS)
- Washing-Solution (WS)
Composition
・ HEPES within Basic
Culture Medium
・ Trehalose
・ Hydroxypropyl
Cellulose
PROTOCOLO VITRIFICACIÓN
ES
VS
PROTOCOLO DESVITRIFICACION
VITRIFICACION OVOCITOS
PROTOCOLO VITRIFICACIÓN
PARA EMBRIONES
CONCLUSIONES
SOBRE VITRIFICACIÓN
•
•
•
•
•
MEJOR CONSERVACIÓN DE LA ULTRAESTRUCTURA Y MENOR
LESIÓN DE LA FISIOLOGÍA OVOCITARIA Y EMBRIONARIA. PROPORCIÓN DE EMBARAZO ES SIMILAR A LA COMUNICADA
PARA CICLOS EN FRESCO
NACIDOS PARA LA VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS PARECE
TENER UNA INCIDENCIA DE ANOMALÍAS CONGÉNITAS (2.5%)
NO MAYOR A LA COMUNICADA PARA LOS NACIDOS DE
EMBARAZOS ESPONTÁNEOS EN MUJERES FECUNDAS O DE
CICLOS FRESCOS DE FECUNDACIÓN IN VITRO.
PROPORCIONA ELEVADA SUPERVIVENCIA OVOCITARIA,
FECUNDACIÓN, DESARROLLO EMBRIONARIO Y EMBARAZO.
ES UNA TÉCNICA SENCILLA Y ALTAMENTE REPRODUCIBLE
GRACIAS
POR SU
ATENCIÓN