Procesamiento del ARN - Departamento de Quimica Biologica
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ARN 2009 Procesamiento del ARN Elba Vazquez Departamento de Química Biológica Email: elba@qb.fcen.uba.ar U6snRNP • S: exón -(4tioU) intrónexón + extracto spl • UV cross-linking 4tioU a ARN • Electroforesis Conclusiones • U6 se une al nt 2 del intrón Evidencia por reversión del crosslinking • U6 se asocia a S antes de formación lazo U6 precursor, U6 lazo y U6-U2 Steitz, 1991 Doble reconocimiento U1 y U6 Sitio 5’ Prueba de lectura para mejorar la especificidad del splicing U2snRNP • La secuencia del punto de ramificación es complementaria a U2snRNP • Estudios genéticos demostraron que el apareamiento de bases es esencial para el splicing Guthrie y col, 1987 Interacciones U2 • Con secuencia en el sitio de ramificación • Entre residuos 56-59 de U6 y 26-28 de U2 hélice I • Entre extremo 5’de U2 y extremo 3’ de U6 hélice II Alta eficiencia de splicing Complejos U6/U2 y el pre-RNAm durante los dos pasos de splicing Valadkan (2007) Biol. Chem. 388: 693-697 Identificación de los sitios de unión de U5 y U6 Primer extension blockage • 4-tioU en = posiciones • Cross linking de los Complejos • Análisis de extensión de primers específicos para U5 o U6 RESULTADOS • U5 sufre cross linking con la última base del Exón 1 • U5 sufre cross linking con la primera base del Exón 2 • U6 sufre cross linking con la segunda base del intrón Interacción U5 y U6 con el sustrato de splicing Science (1993) 262:1995 U5snRNP se asocia con el último nt de un exón y el primer nt del próximo. Esto alinea los dos exones para el splicing U5 forma interacciones por apareamiento de bases no canónicas U4/U6 snRNP Guthrie, 1991 U4snRNP • Asociación de U4 con U6 • Formación de stem I y stem II ¿Interviene U4 directamente en el splicing? U4 secuestra U6 hasta que se necesite para la reacción de splicing Modelo U5 loop U6 dominio ID secuencias guía internas dominio IC U2-U6 hélice I dominio V U2-punto ramif hélice dominio VI Stotheimer & Steitz (1993) U6 snARN está involucrado en la catálisis In vitro Fragmentos de U2 y U6 + oligont intrón de levaduras (con secuencia branching) U6 pueden catalizar la primera reacción de splicing U2 Apareamiento de bases entre los 3 ARN Dominios catalíticos de U6: ACAGAGA AGC Valadkhan & Manley, 2001 Br Primera reacción de splicing in vitro Mg2+, U2, U6, BP en intrón forman el centro catalítico del spliceosoma Valadkhan & Manley (2003) RNA 9: 892-904 snARNs: catalizadores del splicing Spliceosoma Red dinámica: 200 proteínas + 5 ARNs Interacciones ARN-ARN, ARN-proteínas, proteínas-proteínas sn ARNs unen y coordinan los sitios de spl y el sitio de branching participan de la catálisis Dominios en U6 ACAGAGA AGC Stem loop intramolecular (ISL) Metal divalente: activación del 2’-HO del Br point A y estabilización de la carga negativa del grupo saliente Factores de spl participan de la catálisis?? Prp8 la proteína más conservada CORE catalítico del spliceosoma Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9:603–608 Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9:603–608 Mutaciones En A En G En C podian ser suprimidas por mut compensatorias en U2 si restauraba la helice Ib pero no eran viables si formaba lU6ISl extendido sensibilidad extrema mayoritariamente bien toleradas rol catalítico El ciclo del spliceosoma Pre-ARNm inmobilizado sobre esferas de agarosa Matriz avidina – RNA ancla biotinilado Probes* para todos los snRNAs Science (1988) 242 Interacciones por apareamiento de bases Que rol cumplen las proteínas Sm??????? Secuencia de reconocimiento: AAUUUGUGG El ciclo del spliceosoma Selección del sitio de splicing 3’ √ AG 18 a 40 nt downstream de la secuencia branchpoint √ Slu7 es necesario para la selección del AG correcto • Extracto depletado de Slu anti-Slu7 ligado a esferas de Seph • Extracto mock depletado √ Splicing en el AG correcto es suprimido en ausencia de Slu7 Chua y Reed, 1999 Factores de splicing Fidelidad de la elección del sitio 3’de splicing Functional recognition of the 3’ splice site AG by the splicing factor U2AF35 S. Wu, C. Romfo, T. Nilsen & M. Green Nature (1999) 402: 832 U2AF 35 interacciona con AG Requerimientos para la interacción U2AF35-3’ss a. El di nt AG es necesario b. La unión de U2 AF 35 compromete 3 nt upstream y 12 nt downstream del sitio 3’ La interacción U2AF35-3’ss aumenta la afinidad de union de U2AF La unión estable de U2AF depende de la interacción U2AF35-3’ss La interacción U2AF35-3’ss es necesaria para el splicing de intrones AG dependientes Poli Y 14nt Poli Y 28nt Intrones AG-dependientes tienen tractos Poli(Y) DEBILES Intrones AG-independientes tienen tractos POli(Y) FUERTES U2AF POli(Y) FUERTE POLI(Y) DEBIL U2AF 65 NN…………AG AG U2AF 35 SPLICING EFICIENTE requiere contacto adicional Commitment: SC35 Ensayos de competencia √ √ √ √ Exceso de ARN con sitio 5’ inhibía splicing ARN con sitio 3’ no era tan buen competidor SC35 era el factor limitante Condiciones de Commitment SC35 miembro de proteínas SR Fu, 1993 Commitment: otros factores Especificidad commitment SF2/ASF causaba spl commitment con este ARNm diferentes pre-ARNm requieren diferentes factores Fu , Nature (1993) 365: 82-85 Cis-splicing R purina Y pirimidina También factores en trans…. Elementos del sitio de splicing y ensamblaje del complejo Localización simultánea de hnRNPs y snRNP en transcriptos nacientes Microscopía confocal Salivary gland polytene chromosomes stained with: anti-hrp36 antibodies (Texas red - señal verde) anti-snRNP antibody Y12 (FITC – señal roja) Las flechas marcan el loci 1A con más snRNPs y loci 2A con más hrp36. The Journal of Cell Biology (1993) 121: 224 Reversible cross-linking combined with immunoprecipitation to study RNA–protein interactions in vivo Methods (2002) 26:182-190 Inmunoprecipitación de RNP para estudiar las interacciones RNA-proteína in vivo - Anticuerpos anti-Sm (componentes de la maquinaria de Splicing) - Primers especificos para snRNA Ensayo de Inmunoprecipitación de RNPs RIP ASSAY Ensamblaje del spliceosoma y requerimientos de ATP TRENDS in Biochemical Sciences (2005) 30: 469-478 Mecanismo del splicing del ARNm Elucidación de elementos en cis y factores en trans depende de: 1. 2. 3. Mutagénesis sitio-dirigida de genes in vitro, y analizar su expresión in vivo (levaduras y HeLa) Desarrollo de extractos de splicing de uso adecuado (levaduras y HeLa) Aislamiento de mutantes defectivas en splicing temperaturasensibles Commitment en levaduras Abovich & Rosbash, 1997 Commitment en levaduras Complejo commitment en levaduras: √ BBP se une a U1 snRNP en 5’ intrón y a Mud2p cerca de 3’ intrón √ BBP se une al ARN cerca de 3’ intrón Puente y define intrón antes de spl mBBP = SF1 Abovich & Rosbash, 1997 Interacciones intrón - proteína puente - proteína Abovich & Rosbash, 1997 SPECKLES • Estructuras subnucleares enriquecidas en factores de splicing y localizadas en las regiones intercromatina del nucleoplasma • Irregulares y punteadas, de forma y tamaño variable • Dinámicas Speckles Inmunomar cación: Ab Y12 Spl Factors: localizados en el núcleo en forma de speckles Cuerpos de Cajal Dapi staining: ADN Función de los SPECKLES • Función almacenamiento/ensamblaje/modificación suministran Spl F a sitios de transcripción splicing – transporte del pre-ARNm • Composición Factores de splicing: snRNPs y prot SR Kinasas y fosfatasas • Dinámica Responde a señales metabólicas y ambientales Modulación de la transcripción afecta la organización de los speckles RNA spl factors localizados en speckles y en nucleoplasma (difuso) Act D: speckles más grandes y redondeados Dinámica de los speckles: el modelo del intercambio regulado CT: Chromosome territory TC: transcription Complex IGC: Interchromatine granule cluster Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Medición de los parámetros relacionados con la movilidad de las moléculas • Iluminación con láser de alta intensidad • Registro de la recuperación de la fluorescencia • Modelo cinético Antes de la irradiación + ) k ( n ió Asociac Proteínas en una estructura - ) n (k ó i c a i c Diso Proteínas libres en el citosol Después de la irradiación Núcleo Mucus Actina La cantidad de ciclos de emisión del fluoróforo posterior a la exposición al láser depende de la estructura molecular y del ambiente Recuperación Parcial de la Fluorescencia Recuperación de la fluorescencia Cuerpo nuclear Nucleoplasma Curva de recuperación de la fluorescencia SRm160 • Pertenece a la familia de proteínas SR-relacionadas de unión a la matriz • Co-activador del splicing • Estimula el clivaje de transcriptos en la región 3’ • Está presente en EJC Dependencia del ATP Dependencia de secuencias de los motivos Proteínas de procesamiento del RNA: Sm Centrales en el metabolismo del ARN Splicing - Formación de telómeros Objetivo Caracterizar el requerimiento de ATP en la movilidad de EGFP-SRm160 Recuperación de la fluorescencia emitida por EGFPSRm160 en células vivas 90% de recuperación I rel= T0*If/Tt*I0 El tiempo medio de recuperación es 20s Requerimiento de ATP en la movilidad de EGFP-SRm160 en células permeabilizadas con digitonina • La movilidad de EGFP-SRm160 depende de la disponibilidad continua de ATP • El ATP induciría cambios conformacionales responsables de la relocalización de EGFPSRm160
