Procesamiento del ARN - Departamento de Quimica Biologica

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ARN 2009
Procesamiento del ARN
Departamento de Química Biológica
Expresión de genes
Propiedades del ARN
•
•
•
•
Generalmente simple cadena (Alto grado de
plegamiento)
El azúcar es ribosa: -OH en 2’ (-H en deoxi)
AUGC (U reemplaza a T del ADN); pares A:U
El ADN es nuclear en eucariotas; proteínas se
sintetizan en citoplasma; RNA INTERMEDIARIO
Experimentos de pulse chase usando 3H-U
Microscopia electrónica de la transcripción de ARNr
Procariotas
transcripción y traducción simultánea
Eucariotas
transcripción en núcleo
traducción en citoplasma
INTERVALO: Fase post transcripcional ???
ARN en eucariotas
RNA Pol I: rRNA
RNA Pol II: mRNA
RNA Pol III: tRNAs y snRNAs
genes eucariotas
intrones
secuencias sin sentido
exones
secuencias codificantes
Gen eucariota típico
Procesamiento
Details of processing:
•5’ Cap: m7Gppp
(guanyltransferase)
5’Cap
•3’ PolyA (150-200)
AAUAAA: Signals Cleavage of
nascent transcript ca. 20 nt
downstream
Poly A polymerase adds 3’ A
Splicing
Pasos en el procesamiento
del ARN: co-transcripcionales
Capping: modifica el extremo 5’
Clivaje y poliadenilación: forma el extremo 3
Splicing: ocurre en el núcleo antes del
transporte
Split Genes
Exp con SV40: los transcriptos no siempre corresponden a las secuencia
lineales del ADN…
Confirmación por tecnología del ADN recombinante
Encontrado en mRNA, tRNA and rRNA
Gen de la Ovalbumina : Microscopia electrónica
Intron
Intron
Exon
Exon
Secuencia completa de eventos del
procesamiento del ARN.
SPLICING ALTERNATIVO
Gran flexibilidad genética
Intrones en diferentes genes
• ARNm (0 a 60)
• ARNr
• ARNt (0 o 1)
• Genes en mitocondria
• Genes en cloroplastos
ARNhn es el precursor del ARNm
HIBRIDIZACION ARN - ADN
Weissmann y col. 1978
Splicing
los intrones son removidos
Clases de intrones
Auto - splicing
Grupo I: genes nucleares, mitocondriales y
cloroplásticos que codifican para ARNr, ARNt y
ARNm, en Tetrahynena, Physarum, hongos y
phage T4
Grupo II: transcriptos primarios de ARNm
mitocondrial o cloroplástico en hongos, algas y
plantas
No auto - splicing
Splicing de transcripto primario de ARNm:
spliceosoma
Splicing de ARNt de levaduras
Intrones no auto splicing
Transcriptos primarios de ARNm
Se forma el intermediario lazo
Requiere:
• small nuclear ribonucleoproteins: snRNP
o snurps
• small nuclear RNA: snRNA (U1, U2, U4,
U5, U6)
Señales de splicing
• exon GU-intrón-AG
exón
• secuencia consenso
5’-AG GUAAGU-intrón-YNCURAC-YnNAG G-3’
Y: U o C
A
R: purina
Yn: 9 pirimidinas
N
• en levaduras
5’- GUAUGU-intrón-UACUAAC-YAG -3’
Disturbios en secuencias consenso inhibe el splicing
normal
Mecanismo de Splicing: las secuencias son claves
At the 3’ splice site = AG
Other consensus elements further upstream
help define where these splice joints exist.
Small nuclear
RNAs (snRNAs)
act as guides in
the splicing
process: Forms
the splicosome
Most begin with GU end
with AG at the flanks
spliceosoma
Esquema del mecanismo de Splicing en 2 etapas
Reacciones de transesterificación
•
1) - 2’OH de un A interno ataca al
fosfodiester que une el extremo 5’
del intrón al exón 1, produciendo el
LAZO y moléculas 5’ exón
•
2) - 3’OH del exón 5’ ataca al
fosfodiester que une el comienzo del
exon 2 y el extremo 3’ del intrón,
ligado a los exones
•
El intrón se libera como lazo
•
El N de fosfodiésteres se
conserva!!!!
El splicing puede estudiarse in vitro
Hicks y col. Methods (2005) 37: 306
ME: Suero control
DO: antisuero anti RNA-prot
PAGE 4%
PAGE 10%
Sharp y col, 1984
Análisis de los productos de la reacción de splicing
in vitro
Cinética del Splicing In vitro.
Extracto nuclear de Hela
Pre - radioactively labeled
precursor RNA
The splicing reactions were
separated by gel electrophoresis.
Notice that the intron and intronexon RNAs have an unusually
reduced mobility in these
polyacrylamide-urea gels.
¿Es este ARN atípico producto del splicing?
Sharp y col, 1984
Mecanismo de splicing en 2
etapas: predicciones
• intrón spl tiene un grupo 3’ OH
• exón P exón
sitio spl 3’downstream
• intrón spl y exón 2+intrón
nt ramificado (2’, 3’ y 5’ OH unidos a nt)
• extremo 5’ del intrón en la
ramificación
Mecanismo de la RNasa T1 y
T2
La ramificación involucra el extremo
5’ del intrón unido a un sitio dentro del
intrón
Conclusión
Los RNAm nucleares sufren splicing vía un intermediario
ramificado o tipo lazo
Sharp y col.
¿Como ensayamos el splicing?
Comparamos la secuencia del
ADN con la del ARNm maduro
RT-PCR
Síntesis de la sonda para el ensayo de protección de la
ribonucleasa (RPA)
Señal de ramificación
A dentro de región especial del intrón
WT
Splicing
Mutante 1
No splicing
Mutante 2
Splicing
aberrante
Mutante 3
Splicing aberrante
Secuencia
UACUAAC
Gen: actina de levaduras
Langford y Gallwitz,
1983
RESUMEN
Los precursores de los ARNm sufren splicing
Se forma el intermediario lazo
Requiere:
• Secuencias consenso en los extremos 5’ y 3’ de los
intrones
• Secuencias consenso en el punto de ramificación
En levaduras: UACUAAC y determina cual AG
downstream es el sitio 3’ de splicing
En eucariotas superiores: UNCURAC
El nt del BP is la A final
Spliceosomas: intermediarios unidos a
partículas
Spliceosoma humano
levaduras
snRNAs y snRNPs
Small nuclear RNAs
• son los agentes que reconocen las
señales de splicing
• Actúan acoplados a proteínas
•
Small nuclear ribonuclear proteins
“snurps’’
Se unen al spliceosoma y juegan roles
críticos
RNA que esta siendo sintetizado
U1, U2, U4, U5 y U6
snARN son abundantes en el núcleo
Reconocimiento de los sitios de
splicing
sitio donor 5
Y: C o U
sitio de ramificación
sitio aceptor 3
N: cualquier nt
• snRNA U1 reconoce la secuencia en el sitio donor
interacción por apareamiento de bases
• snRNA U2 se une al sitio de ramificación
interacción por apareamiento de bases
Splicing en los transcriptos
primarios de ARNm
Spliceosoma: ensamblaje de la
maquinaria de splicing
Spliceosoma: ensamblaje de la
maquinaria de splicing
Spliceosoma: los grupos reactivos
entran en estrecha proximidad
U5 funciona como puente
Formación del spliceosoma
U1snRNP
13S
12S
9S
Adenovirus E1A
Apareamiento de bases entre U1 snRNA y el sitio 5’ de
splicing es necesario pero no suficiente
Porque cambios en U1 fallan en compensar cambios de bases en el
sitio 5’ spl?
Es necesario proteína/s que reconozca la secuencia en 5’????
U6snRNP
• S: exón -(4tioU) intrónexón + extracto spl
• UV
cross-linking
4tioU a ARN
• Electroforesis
Conclusiones
• U6 se une al nt 2 del intrón
Evidencia por reversión del crosslinking
• U6 se asocia a S antes de
formación lazo
U6 precursor, U6 lazoy U6U2
Steitz, 1991
Doble reconocimiento
U1 y U6
Sitio 5’
Prueba de lectura para mejorar la
especificidad del splicing
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