Agenda - El Comprimido

Javier Pemán
Unidad de Micología
Servicio de Microbiología
Hospital Universitario La Fe
Valencia
Diagnóstico microbiológico de
la IFI
Palma de Mallorca, 11 febrero 2010
Agenda
1. Examen microscópico directo
2. Cultivo de hongos:
3.
4.
5.
Ventajas e inconvenientes
Utilidad
Detección de Ag
Dtico serológico
Técnicas moleculares
Diagnóstico
micológico
Procedimientos
laboratorio
Sospecha clínica
Detección del
organismo en el
tejido
Examen directo
Estudio histológico
Cultivo de la
muestra
Aislamiento
Identificación
Confirmación
Confirmaciónsospecha
sospechaclínica
clínica
Elección
Eleccióntratamiento
tratamientoespecífico
específico
Diagnóstico micológico
Requerimientos clínicos:
Datos clí
clínicos de interé
interés:
Datos epidemioló
epidemiológicos:
gicos:
Comienzo, Evolució
Evolución, Tratamientos, ...
Trabajo, Contacto con animales, Viajes, etc.
Enví
Envío de muestras correctamente
identificadas y en el contenedor adecuado
Agenda
1. Examen microscópico directo
2. Cultivo de hongos:
3.
4.
5.
Ventajas e inconvenientes
Utilidad
Detección de Ag
Dtico serológico
Técnicas moleculares
Examen microscópico directo
Ventajas:
Rentabilidad:
Permite un diagnó
diagnóstico presuntivo rá
rápido (min)
Facilita la instauració
instauración precoz del tratamiento
En funció
función de la experiencia del observador
Inconvenientes:
No permite la identificació
identificación del agente causal
Microscopía y Cultivo
+
Sensibilidad diagnóstica:
15 - 20% > Cultivo sólo
Denning, CID 1998
Microscopía “directa”
Muestras
álidas:
Muestras vválidas:
LLíquidos
íquidos esté
ériles,
est
estériles,
biopsias
biopsias
Respiratorias
Respiratorias
(LBA,
(LBA,AT,
AT,BAS)
BAS)
Abscesos,
Abscesos, heridas,
heridas,
...
...
•• Técnicas
Técnicas microscópicas:
microscópicas:
–– KOH
KOH
–– Contraste
Contraste de
de fases
fases
–– Tinciones
Tinciones específicas:
específicas:
•• Calcoflúor
Calcoflúor
•• Plata
Platametenamina,
metenamina,PAS
PAS
Examen microscópico directo
C. neoformans
Scopulariopsis spp.
Malassezia spp.
Examen microscópico directo
© J. Pontón
Blanco de Calcoflúor
Examen microscópico directo
© J. Pemán
Naranja de Acridina
Examen microscópico directo
Valor
ía:
Valor de
de la
la Microscop
Microscopía:
Sensibilidad:
Sensibilidad: ∼∼ 50%
50%
Especificidad:
Especificidad: >
> 90%
90%
No
éneros
ggéneros
No discrimina
discriminaentre
entre gé
Tinciones “micológicas”
Giemsa: histoplasmosis
PAS: IFI, micetoma, coccidioidomicosis,
onicomicosis
Grocott: IFI, pneumocistosis
Tinciones “micológicas”
Aspergillus (Grocott)
Tinciones “micológicas”
Pneumocystis jiroveci (Grocott)
Agenda
1. Examen microscópico directo
2. Cultivo de hongos:
Ventajas e inconvenientes
Utilidad
3. Detección de Ag
4. Dtico serológico
5. Técnicas moleculares
Cultivo micológico
Objetivo:
Aislamiento
ón agente
identificaci
Aislamiento ee identificació
identificación
agente causal:
causal:
Medios:
Diagnó
óstico etioló
ógico de
ón fú
úngica
Diagn
etiol
infecci
ffúngica
Diagnóstico
etiológico
de la
la infecció
infección
Estudio
úngica
antif
Estudio de
de sensibilidad
sensibilidad antifú
antifúngica
Aislamiento:
Aislamiento:
Agar
Agar Sabouraud
Sabouraud glucosado
glucosado (+
(+ cloranfenicol)
cloranfenicol)
Agar
Agar Mycosel
Mycosel (dermatofitos)
(dermatofitos)
Agar
ó n cerebro
ó n (BHIA)
infusi
coraz
Agar infusió
infusión
cerebro corazó
corazón
(BHIA)
Agar
Leeming
o
Dixon
(
Malassezia
Agar Leeming o Dixon ( Malassezia spp)
spp)
Agar
Agar Staib
Staib ((Cryptococcus
Cryptococcus spp)
spp)
Identificació
ón:
Identificaci
Identificación:
HH filamentosos:
filamentosos: SDA,
SDA, PDA,
PDA, MEA,
MEA, Czapek
Czapek
Dermatofitos:
PDA,
Agar
tricophyton
Dermatofitos: PDA, Agar tricophyton
Levaduras:
Levaduras: CHROMagar
CHROMagar Candida,
Candida, Corn
Corn Meal,
Meal, …
…
Condiciones de Incubación
Soporte:
Tubo (!!)
Placa Petri 90 mm
Temperatura:
30º
30º C (humedad)
No:
Tª ambiente
Dos temperaturas (30º
(30º y 37º
37º C)
Tiempo:
Muestras esté
estériles y LBA: 4 semanas
Otras muestras: 2 semanas
Cultivo micológico
Muestras válidas IFI
LLíquidos
íquidos orgá
ánicos:
org
orgánicos:
LCR
LCR
LLpleural
pleural
LLperitoneal
peritoneal
LLarticular
articular
Humor
ítreo
vvítreo
Humorví
Orina
Orina
Biopsia:
Biopsia:
Abscesos
Abscesos
Mucosas
Mucosas
Viscerales
Viscerales
Respiratorias:
Respiratorias:
Hemocultivo
Hemocultivo
LBA
LBA
Cultivo
Muestras NO estériles
(respiratorias)
¿¿ Contaminación
Contaminación ??
¿¿ Colonización
Colonización ??
¿¿ Infección
Infección ??
Hemocultivo
Técnicas:
Manuales:
Semiautomá
Semiautomáticas:
Radiomé
Radiométricos
Automatizadas:
Medios lí
líquidos, bifá
bifásicos
CO2, pH, redox, enzimas,..
LisisLisis-centrifugació
centrifugación
Sensibilidad
Sensibilidad global:
global: ≈≈ 50%
50%
Sistemas automatizados
hemocultivo
BacT/Alert 3D®
(bioMé
(bioMérieux)
Sistemas automatizados
hemocultivo
Tipos de botellas
Botellas convencionales para bacterias
Infecciones sistémicas por H filamentosos (Fusarium)
Sepsis mixtas (bacterias + levaduras)
Botellas espec
íficas para hongos:
específicas
Mycosis-IC F®® (Bactec-Becton Dickinson)
Mycosis
(Bactec
Mycosis-IC
(Bactec-Becton
MYCO/F LYTIC®® (Bactec-Becton Dickinson)
(Bactec
(Bactec-Becton
Infecciones sistémicas por H. capsulatum
Sistemas automatizados
hemocultivo
Nº de botellas y volumen
inoculación
Dos frascos en cada extracción (aeróbico
y anaeróbico): 10 ml/frasco
En niños, frasco pediátrico (un sólo frasco
por extracción): 5 ml/frasco
Sistemas automatizados
hemocultivo
Detección crecimiento
Tinció
Tinción:
Gram
Naranja acridina
Si estructuras fú
fúngicas:
Subcultivo en SDAC y CHROMagar
Candida® (levaduras)
Sistemas automatizados
hemocultivo
© J. Pemán
Tinción de Gram
Sistemas automatizados
hemocultivo
© J. Pemán
Naranja de Acridina
Sistemas automatizados
hemocultivo
© J. Pemán
Naranja de Acridina
Sistemas automatizados
hemocultivo
Tiempo incubación
NO crecimiento
7 días 21 días
Final incubación:
Subcultivo ciego + examen
microscó
microscópico
+
Hemocultivo
Velocidad de crecimiento
284 candidemias H Univ La Fe
(2004(2004-2008):
Media: 36,8 h (2,2 h - 7,5 d)
Mediana: 31,5 h
C. albicans:
albicans: 33,7 h (8,7
(8,7 h
h -- 5,6
5,6 d)
d)
C. parapsilosis:
parapsilosis: 30,7 h (2,2
(2,2 h
h -- 55 d)
d)
C. glabrata:
glabrata: 35,5 h (7,5
(7,5 h
h –– 5,1
5,1 d)
d)
C. tropicalis:
tropicalis: 18,1 h
Hemocultivo
Velocidad de crecimiento
284 candidemias (H Univ La Fe):
%
) →
(
,
días
2
los
a
i
S
ivo
t
l
u
moc
e
h
etir
p
e
r
Hemocultivo
Baja sensibilidad
Hongos:
Presencia transitoria en sangre
perifé
periférica:
Intracelular (fagocitos)
Atrapamiento en capilares
“Lenta”
Lenta” velocidad de crecimiento
y multiplicació
multiplicación:
Sepsis mixtas (levad + bacteria)
50 %
Hemocultivo
Aumentar sensibilidad
• Si firme sospecha clínica de candidemia y sólo se
aíslan bacterias contaminantes G+…
• Subcultivar 10 ml del hemocultivo positivo en un
frasco de Mycosis-IC/F suplementado con 5 mg/l de
vancomicina (0,1 ml de Diatracín® 500 en 10 ml de solución
salina e inocular 0,5 ml en el frasco) y procesar de forma
habitual en el arcón incubador.
Pemán J, Ramos P, Iglesias I: Procesamiento de las muestras de sangre, líquidos estériles y tejidos.
Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica 2ª Ed, Bilbao 2007
Identificación de la especie
• ¿Cuándo?:
–– Siempre
Siempre
–– Como
Como mínimo:
mínimo:
–– Muestras
Muestras estériles
estériles (líq
(líq orgánicos,
orgánicos,
biopsias)
biopsias)
–– Punta
Punta catéter
catéter IV
IV
• ¿Por qué?:
––
––
––
Interés
Interés epidemiológico
epidemiológico
Interpretación
Interpretación clínica
clínica
Repercusiones
Repercusiones terapéuticas
terapéuticas
PNA FISH
Peptide Nucleic Acid Fluorescent InIn-situ Hybrydization
AdvanDX; Woburn, MA
PNA FISH
Peptide Nucleic Acid Fluorescent InIn-situ Hybrydization
•• Sencilla
Sencilla
C. albicans
C. glabrata
•• Poco
Poco equipamiento
equipamiento
•• Rápida
Rápida (150
(150 →
→ 85
85 min*)
min*)
•• CE
CE yy FDA
FDA (2003)
(2003)
•“Económica”:
•“Económica”: $$ 30-80
30-80 (~PCR)
(~PCR)
♣
•• ↓↓ Costo
Costo asistencia
asistencia♣ ($
($ 1800)
1800)
*Gherna M et al; JCM 2008, Nov
BD, et al. DMID 2006; 54:277-82
♣ Forrest GN, et al JCM 2006; 44:3381-3
C. albicans + C. glabrata
S. cerevisiae
♣ Alexander
C. albicans PNA FISH™
C. albicans/C. glabrata PNA FISH™
Shepard JR, et al JCM 2008; 46:50-5
AdvanDX; Woburn, MA
PNA FISH
C. glabrata o C. krusei
• C. glabrata / C. krusei
C. albicans o C. parapsilosis
• C. tropicalis
• C. albicans / C. parapsilosis
C. tropicalis
Forrest
-6
2:221
Forrest GN,
GN, Curr
Curr Fun
Fun Infect
Infect Rep
Rep 2008;
2008; 2:2212:221-6
Yeast Traffic Light PNA FISH™
FISH™
Agenda
1.
2.
Examen microscó
microscópico directo
Cultivo de hongos:
3.
4.
5.
Ventajas e inconvenientes
Utilidad
Detecció
Detección de Ag y molé
moléculas no
antigé
antigénicas
Detecció
Detección de Ac
Técnicas moleculares
AdvanDX; Woburn, MA
Detección de antígenos
micosis invasoras
Cryptococcus neoformans
Ag capsular
Aspergillus spp.
Galactomanano
GM en Suero Sensibilidad/Especificidad
Platelia-Aspergillus ®®
S
S (%)
(%)
E
E (%)
(%)
oo
g
g
s
s
iiee
r
82.5
81-98
82.5
81-98
r
o
• 71% S y 89% E en AI probada
aalltto89
CAILLOT
1997
100
CAILLOT
1997
100
89
• 65%
S en AI probada o probable
s
s
o
o
c
i
nnic
MACHETTI
1998
67
98.2
MACHETTI
1998
67
98.2
é
é
p
p
o
MAERTENS
1999
95.4
ttrro92.6
MAERTENS
1999
92.6
95.4
u
u
e
e
n
ss n
MAERTENS
2001
89.7
98.1
MAERTENS
2001
89.7
98.1
o
o
m
rm
eer2003
PINEL
50
99.6
PINEL
2003
50
99.6
f
f
n
↓ Sensibilidad en TOS:
n
e
e 2004
n
HUSAIN
(TP)
30
en Tx hepático* 95
HUSAIN
(TP)
2004 • 56% (94% E)
30
95
n
e
e
l
i
•
30%
(93%
E)
en Tx pulmonar**
l
i
t
PEMAN
2004
77.4
90.6
ÚÚt
PEMAN
2004
77.4 *
90.6
VERWEIJ
1995
VERWEIJ
1995
Meta-análisis
27 estudios (66-05):
SULAHIAN
1996
SULAHIAN
1996
90
90
84
84
Pfeiffer CD, CID 2006, 42;1417-27
Fortun J, Transplantation2001
**Husain S, AM J Transplant 2004
GM en LBA
9 estudios heterogéneos:
• Sen: 60 → 100%
• Esp: 77 → 100%
Kwak EJ, Curr Fungal Infect Rep 2008; 2:206-13
Punto Corte de 0,5 (BAL):
• Sensibilidad: 88%, (42% en suero
y 58% cultivo BAL)
• Especificidad: 87%
Monitoriza
Monitorizala
larespuesta
respuesta
terapéutica
terapéuticasegún
según
cuantificación
cuantificaciónGM
GMyy
evalúa
evalúaelelpronóstico
pronóstico
A considerar:
• Neutropénicos mayor rentabilidad
suero
• Falsos positivos colonización (TxP)
Meersseman W. Am J Respir Crit Care Med. 2008; 177:27-34.
GM en LBA
•73 ptes con infiltrados pulmonares
•6 con apergilosis pulmonar
•GM en LBA:
•S: 100%, E:88%, VPN: 100%, VPP: 43%
•GM en LBA + Ex directo:
•S: 100%, E:92%, VPN: 100%, VPP: 55%
• There was no conclusive benefit of determining BAL GM levels in
the
diagnosis
of
pulmonary
aspergillosis
among
nonimmunocompromised hosts.
• Given the likelihood of false-positive results, a BAL GM test should
not be ordered routinely in this population.
J Clin Microbiol 2008; 45:2787-92
(1-3)-β
β-D glucano (Fungitell®)
Componente de la pared fú
fúngica
Alto nivel de detecció
detección (20 ϕ g/ml)
Comú
Común a muchos gé
géneros de hongos:
•
•
•
•
Aspergillus, Candida,
Candida, Pneumocystis
NO: Cryptococcus, Zigomicetos
Técnica laboriosa
No distingue entre géneros
Numerosos falsos positivos:
•
•
•
•
Ig, memb celulosa, gasas y esponjas, hemólisis…
Albúmina, Fact coagulación, prot plasmáticas…
Bacteriemia, quimioterapia, coloniz GI Candida…
Amoxi-clav, piper-tazo…
(1-3)-β
β-D glucano (Fungitell®)
Pocos estudios prospectivos
Tasa de falsos negativos desconocida:
↑ Bilirrubina y triglicé
triglicéridos
Colonizació
Colonización vs infecció
infección
Contaminació
(manipulación, glucanos ambientales)
Contaminación (manipulació
Muchas dudas por resolver…
• Influencia del tto AF previo
• Punto de corte óptimo: ¿60 pg/mL?
• Punto de corte ¿estático / dinámico?
• Cinética
• Frecuencia de muestreo ¿bisemanal?
(1-3)-β
β-D glucano (Fungitell®)
Uso en Laboratorios de Referencia
Frecuencia: semanal durante mayor riesgo de EFI
Los (+) deben complementarse con otras pruebas para
identificar la especie
Su uso conjunto con otro marcador  los FP y  Esp
•
•
•
•
BG
BG
BG
BG
= GM: S (87%), E (89%), VPP (70%), VPN (96%), FP (10%)
y GM > precoces que el diagnóstico clínico y TAC
> precoz GM
+ GM: E (100%), VPP (100%), ≈ S, ≈ VPN
Pazos C, J Clin Microbiol 2005
Agenda
1. Examen microscópico directo
2. Cultivo de hongos:
3.
4.
5.
Ventajas e inconvenientes
Utilidad
Detección de Ag
Detección de Ac
Técnicas moleculares
Detección Anticuerpos
Candidiasis invasora
®
Candida
Candidaalbicans
albicansIFA
IFAIgG
IgG®
Detección Anticuerpos
Candidiasis invasora
Ac antimanano
Ac antimicelio
+ en colonización e infección
+ en infección
Ac antimicelio
Candida
Candidaalbicans
albicansIFA
IFAIgG
IgG
• C. albicans
• C. tropicalis
• C. parapsilosis
• C. krusei
• C. glabrata
• C. guilliermondii
• C. dubliniensis
Clinical Significance of Candida albicans Germ Tube
Antibody Detection in Critically Ill Patients
Zaragoza R, Pemán J, et al.
• Estudio prospectivo (2 años)
• Multicéntrico (6 UCIs)
• 53 ptes no neutropénicos
• El % de CAGTA+ en ptes críticos es alto (41,5%)
• Sobretodo en ptes quirúrgicos (54,5%)
• La presencia de este marcador se asocia con menor mortalidad
• Probablemente debida al tto AF recibido (¿”candidiasis serológica”?)
Clin Microbial Infect 2008; 15:592-595
22/53 CAGTA +
• Estudio prospectivo (2 años)
• Multicéntrico (6 UCIs)
• 53 ptes no neutropénicos
31.8% Títulos crecientes
36.4% Títulos decrecientes
22.8% Títulos invariables
Clin Vaccine Inmunol 2009; 16:1527-8
Agenda
1. Examen microscópico directo
2. Cultivo de hongos:
3.
4.
5.
Ventajas e inconvenientes
Utilidad
Detección de Ag
Dtico serológico
Técnicas moleculares
Diagnóstico molecular
Tipo de muestras válidas
Sangre y suero
Fluidos estériles:
líquido cefalorraquídeo
humor acuoso y vítreo
líquidos de derrames
Lavado broncoalveolar
Tejidos
Diagnóstico molecular
¿Ventajas?
Elevada sensibilidad:
Diagnóstico molecular
Técnicas disponibles
• Técnicas caseras (in-house)
• Múltiplex, anidada, tiempo real…
• Técnicas comercializadas:
•SeptiFast (Roche)
•FXG
-RESP (Asp+) (Myconostica Ltd, IZASA)
Diagnóstico molecular
Técnicas caseras
Diagnóstico molecular
LightCycler® SeptiFast Test
• Es la primera prueba basada en PCR para la detección múltiple de
patógenos causantes de sepsis
• PCR en tiempo real (cualitativa)
• Detecta el 90% de los agentes causales de bacteriemia/fungemia
• Comercializada en Europa (CE Mark) enero 2006
• No en EE.UU.
Diagnóstico molecular
LightCycler® SeptiFast
Detecta e identifica DNA de 25 patógenos bacterianos y fúngicos
directamente de sangre total (EDTA) en menos de 6 horas:
Hongos
Diagnóstico molecular
LightCycler® SeptiFast
MagNA Pure Compact
Instrument
30 min
240 min
Actualización gentileza del Dr. J.C. Palomares
0,4
50-200
MagNA Pure Compact
Nucleic Acid Isolation Kit I
Diagnóstico molecular
LightCycler® SeptiFast
Diagnóstico molecular
FXG
: RESP (Asp+)
CE Mark 2008 FDA approval 2008
Detección rápida de ADN
de Aspergillus y
Pneumocystis en muestras
respiratorias mediante
PCR en tiempo real
Myconostica Ltd