Resumen: M-084 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Expresion en medula osea murina de Bcl-xL, Bax y del receptor de eritropoyetina durante la recuperacion post-ciclofosfamida Juaristi, Julián A. - Alvarez, Mirta A. - Aguirre, María V. Todaro, Juan S. - Sanabria, Oscar - Brandan, Nora C. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE. Moreno 1240. C.P : 3400. Corrientes. Argentina. Tel-fax:03783-435378. E-mail: nbrandan@med.unne.edu.ar La hematopoyesis es un sistema en estado estacionario, intensamente estudiado cuyos mecanismos regulatorios son todavía pobremente comprendidos. Se acepta que una intrincada red de citoquínas , liberadas en parte por las mismas células que se diferencian, actuando en forma sinérgica, redundante, pleiotrópica y hasta antagónica, regulan estos procesos, conformando un sistema de interacciones azarosamente interferidas que han dado en llamarse “cross-talk” (1,2,3) Cuando el sistema es perturbado, por ejemplo por acción de citotóxicos, aunque los modos de acción difieran, se activan mecanismos comunes intentando restablecer el equilibrio. Clásicamente se han descrito dos tipos de efectos, la necrosis o muerte celular pasiva , donde median procesos inflamatorios y la apoptosis o muerte celular programada. Respecto al primero, se sabe que la injuria producida por estas drogas induce la expresión de moléculas proinflamatorias ( TGF β, TNF alfa e Il-1) y secundariamente citoquinas que pueden afectar diferencialmente el crecimiento de los progenitores.(4,5,6). La apoptosis en cambio, es un activo proceso fisiológico que puede ser inducido por una variedad de estímulos. Implica una serie de cambios morfológicos y metabólicos que culminan con la activación de endonucleasas que van a fragmentar de manera típica el ADN a nivel internucleosomal. En su regulación, cumplen un papel central las Bcl 2, una familia de proteínas tanto pro como antiapoptóticas. Mientras algunos miembros de esta familia bloquean la apoptosis (Bcl 2, Bcl-xL) otros la activan (Bax, Bad) . El balance entre ellas determina la sobrevivencia o la muerte apoptótica (7). Por otro lado Bcl-xL está particularmente implicada en la maduración del compartimiento eritroideo. Su expresión es Epo dependiente y está ubicada corriente abajo en el camino por el cual Epo previene la apoptosis. Por otro lado forzando la expresión de Bcl-xL en las células deprivadas de Epo se inhibe la apoptosis . Además la expresión de Bcl-xL está regulada en alza durante la maduración eritroidea terminal. De manera que ambas, Epo y Bcl-xL, parecen esenciales para la normal diferenciación eritroidea dentro de las células rojas maduras. (8,9) Asumiendo que la acción del citostático implica un reordenamiento de las relaciones entre los elementos en juego, destinado a reestablecer la homeostasia, esto significa, entre otras cosas, cambios cuantitativos y cualitativos en la celularidad medular, expansión de los compartimentos por incremento de la proliferación o restricción de la apoptosis, cambios en la expresión génica. Nosotros nos proponemos analizar la recuperación de la médula ósea murina tras una única dosis de Ciclofosfamida (200 mg/kg de peso) correlacionando la celularidad, la apoptosis y la expresión de proteínas relacionadas (Bcl-xL y Bax) durante 5 días post-tratamiento. Materiales y métodos ANIMALES: Se utilizaron ratones adultos jóvenes isogénicos de la cepa Swiss CF 1(peso aproximado 26-28 g INBIFAR Fac de Medicina UNNE ) que fueron dadores de médula ósea y sangre periférica. ADMINISTRACION DE LA DROGA Y OBTENCION DE MUESTRAS: Ciclofosfamida (CPA) (Endoxan Asta,Labinca 1g ) fue administrado en una única dosis i.p. a una concentración de 200 mg /kg. Los grupos tratados y el control fueron anestesiados con pentobarbital al 3% obteniéndose sangre periférica por punción cardíaca y posteriormente sacrificados por dislocación cervical para la obtención de células de médula ósea a cada tiempo del periodo experimental (0, 6, 12 hs- 1, 2, 3, 4 y 5 días). DETERMINACIÓN DE CELULARIDAD MEDULAR: Se obtuvieron muestras médula ósea (MO) a cada día del esquema experimental por flusheo de los fémures con 500µl de buffer PBS. El recuento celular se realizó en cámara de Nebauer. Todas las determinaciones se realizarán por triplicado. Los resultados se expresan como promedio de células nucleadas por fémur x 106 ± SEM. Las determinaciones se realizaron por triplicado en dos experiencias independientes. -CONTAJE DIFERENCIAL DE CELULAS SANGUINEAS: Se realizaron en preparaciones de médula ósea teñidos con May Grünwald Giemsa. Los precursores hemopoyéticos se clasificaron de acuerdo a los criterios standard, contando 500 a 1000 células nucleadas por duplicado. Los resultados se expresan como porcentaje ± SEM de cada línea. A partir de las celularidades absolutas totales, se obtuvieron las celularidades absolutas de cada compartimiento a los diferentes días de recuperación post-CPA, expresándose los resultados como promedio de células por fémur x 106 ± SEM. OBTENCION DE LISADOS DE TEJIDO HEMOPOYETICO: Supensiones de médula ósea provenientes de cada lote fueron centrifugadas a 700 rpm por 5 minutos y lavados con PBS. Los pellets se trataron con buffer RIPA (NaCl 140 nM, TRIS-HCl 1M pH 7,4, EDTA 37,22mg%, NP40 1%, KCl 15 mM, MgCl2 2 mM y PMSF 1 mM) por 20 minutos en baño de hielo. Los extractos se obtuvieron por pasaje a través Resumen: M-084 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 de agujas de diámetro decreciente, realizando por último una centrifugación refrigerada a 14000 rpm por 20 minutos. La concentración proteica de los sobrenadantes se determinó por el método de Bradford. ELECTROFORESIS EN SDS PAGE Se sembraron 45 microgramos de extractos celulares post-CPA en geles de Acrilamida-Bis acrilamida (30:0.8) , Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) al 12 % . El fraccionamiento proteico se realizó según metodología standard utilizando el equipo de electroforesis horizontal tipo Miniprotean II Electrophoresis Cell(Bio Rad) ELECTROTRANSFERENCIA (ELECTROBLOTTING) Se utilizó para cada electrotransferencia una membrana de nitrocelulosa. La calidad del proceso se evaluó con la tinción reversible convencional de rojo Pounceau S. INMUNODETECCION (westernblotting) Se realizó la secuencia estándar de tratamiento de las membranas: bloqueo, incubaciones y lavados intermedios con buffer TBS según metodología estándar. Se utilizó como sistema de revelación el kit Opti4CN (Bio Rad). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-bax, anti-bcl-XL, anti Epo R (Santa Cruz Biotechnology Inc; Ca USA) y los secundarios: IgG goat anti-rabbit , IgG goat anti-rat marcadas con HRP para westernblotting (Jackson Immunoresearch Inc, Canada) IMÁGENES Y ANALISIS ESTADISTICO Los blottings fueron y analizados usando Adobe Photoshop 7.0 y Scion Image 3.0(NHS USA).Los resultados fueron analizados utilizando el Software INSTAT y PRISM versión 2.0 (Graph Pad Software,San Diego,Ca USA), considerando estadísticamente significativo un p < 0.05. Los gráficos fueron obtenidos mediante el uso del software Graph Pad Prism. Para los estudios de correlación se utilizó el test de Spearman. Discusión de Resultados Una única dosis de CPA, es suficiente para afectar profundamente la arquitectura de médula ósea , tal como se observa en la Figura 1, donde la necrosis se visualiza en la destrucción de la membrana plasmática . El efecto de CPA sobre la celularidad medular es evidente desde la hora 6 y máximo a las 48 horas cuando la celularidad cae al 13% del valor normal. El citotóxico afecta particular , aunque no significativamente, al compartimiento eritroide. Cuando estas celulas son sometidas al western blotting, la expresión de BAX es notoria desde las 0 y hasta las 48 horas, decae entre las 72 y 96 horas, reapareciendo al final de la experiencia. La expresión de Bcl-xL es máxima cuando la de BaX es mínima, mientras que a las 120 horas es notoria la expresión de Epo R (Figura 2). Bax y Bcl-xL son dos proteínas de la familia Bcl-2, la primera es proapoptótica y la segunda antiapoptótica, es razonable que la expresión de ambas muestre relación inversa .BclxL a su vez, está ligada a la sobrevivencia celular y a la expresión de Epo R. Aunque en líneas celulares está descripta corriente abajo respecto de la activación de EpoR, “in vivo”, su sobreexpresión anticipa la aparición de este receptor y puede considerarse un indicador del comienzo de la recuperación eritroide post-injuria. Resumen: M-084 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Conclusiones: 1. La ciclofosfamida destruye la arquitectura medular y esta no se recupera hasta el fin de la experiencia 2. La recuperación celular en medula osea muestra una relacion inversa en las expresiones de BAX y Bcl-xL . 3. La expresión de Bcl-xL anticipa la expresion del receptor de eritropoyetina ( EPO-R ), garantizando la recuperacion del compartimento eritroideo Bibliografía 1 - De Haan, D; Dontje, B; and Nijhof. Concepts of hemopoietic cell amplification. Synergy, redundancy and peliotropy of cytokines affecting the regulation of erythropoiesis. 1996 Leukemia and lymphoma. Vol 22, pp385-396. 2- A. Bauer, O. Grandillon and J. Samarut .Nuclear receptors in hematopoietic development: Cooperation with growth factor receptors in regulation of proliferation and differentiation . Hematopoiesis- A developmental approachs Ed L.I.Zon. Oxford University press 2001 3- Majka, M.; Janoska-Wieczorek, A; Ratajczac, J; Ehrenman, K; Pietrzkowski, Z; Kowalska, A; Gertwirtz A; Emerson S.G.; Ratajczac, M,Z. Numerous growth factors, citokines, and chemokines are secreted by human CD34+ cells, myeloblasts, erythroblasts and megakarioblasts and regulate normal hematopoiesis in an autocrine/paracrine manner. Blood 97: 9075-3025, 2001 Resumen: M-084 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 4 - Allen D.A., Breen C, Yagoob M.M, Macdougall I.C. Inhibition of CFU-e colony formation in uremic patients with inflammatory desease: role of INFgana an TNF alfa J Investig Med. 1999 may:47 (5) 204-11 5 – Robertson, J.D; and Orrenius, S. Critical Reviews in toxicology Vol 30 Issues 5 (2000) pages 609-627 6 – Tood Gregory, Cho Ming Yu, Averil M.A; Orkin S. H; Blabel G.A, and Weiss M.J Gata-1 and erythropoietin cooperate to promote erythroid cell survival by regulating Bclxl expression. Blood, Vol 94 1999. pp 87-96 7 – Peters, R Leyvraz, S; Perey L Apototic regulation in primitive hemopoietic precursors Blood Vol 92 Nro 6 1998 pp 2041-2051 8 - Janoska-Wieczorek, A.; Majka, M. Ratajczac, M .Autocrine/Paracrine mechanisms in human hematopoiesis.Stem Cells 19: 99 – 107; 2001 9 – Vaux D.L; Stasser, A The molecular biology of apoptosis Proc. Natl Acad; Sci USA Vol 93 pp 2239-2244; March 1996